生产聚3羟基丁酸乳酸酯的大肠杆菌基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌基因工程菌，是以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌株，在其基因组中构建了由丙酮酸合成聚3羟基丁酸乳酸酯的代谢途径，其中，所述代谢途径中，催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF编码，或由来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3

【技术实现步骤摘要】
生产聚3羟基丁酸乳酸酯的大肠杆菌基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体地说，是关于一种生产聚3羟基丁酸乳酸酯的大肠杆菌基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates，PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。
[0003]聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有多种理想的性质，如生物降解性、生物相容性和可堆肥性等，且聚乳酸本身无毒。但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。Seiichi Taguchi等利用底物相似性原则，通过对PHA合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯(P(3HB
‑
co
‑
LA))。
[0004]P(3HB
‑
co
‑
LA)是PHA家族的一员，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明但是坚硬、以及聚3
‑
羟基丁酸不透明且易碎的特点，根据乳酸含量而表现出不同的弹性和透明度。如图1所示，目前已知的生物合成P(3HB
‑
co
‑<br/>LA)的途径是利用具有乳酸聚合活性的PHA合成酶(phaC)通过3
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羟基丁酰辅酶A(3HB
‑
CoA)和乳酰辅酶A(LA
‑
CoA)进行合成(Seiichi Taguchi.et al.A Microbial factory for lactate
‑
based polyesters using a lactate
‑
polymerizing enzyme,PNAS,105(45),Nov.18,2008,17323
‑
17327)。其中，3HB
‑
CoA的合成途径是通过β
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酮硫解酶(phaA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)催化乙酰辅酶A生成；LA
‑
CoA的合成途径是通过丙酰辅酶A转移酶(PCT)催化乳酸生成，但是通过改造得到的PCT合成P(3HB
‑
co
‑
LA)时，在未进行改造的菌体内只能达到6％(摩尔比)的乳酸组分的聚合物，然后借助改变培养条件或通过代谢手段来提升乳酸组分，方式复杂且部分甚至会影响细胞的生长，进而降低聚合物的产量。因此有必要加以改进。

技术实现思路

[0005]针对现有生物合成P(3HB
‑
co
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LA)的方法所存在的上述缺点，专利技术人重点研究了乳酰辅酶A通过乳酸合成步骤，试验了很多种具有辅酶A转移或者辅酶A合成功能的酶，最终发现了scot以及YdiF具有催化乳酸生成乳酰辅酶A的活性。
[0006]因此，本专利技术的第一个方面，提供了一种大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌是以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌株，在其基因组中构建了由丙酮酸合成聚3羟基丁酸乳酸酯的代谢途径，其中：
[0007]所述代谢途径中，催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF编码，或由来源于乳酸厌氧菌
(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot编码。
[0008]进一步的，所述来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF的序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]进一步的，所述来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot的序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]根据本专利技术的优选实施例，所述代谢途径中通过3
‑
羟基丁酰辅酶A和乳酰辅酶A合成聚3羟基丁酸乳酸酯的PHA合成酶为来源于荧光假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens strain 2P24)的编码PHA合成酶的基因phaC经过突变后基因phaCm，其序列如SEQ ID No.5所示。
[0011]根据本专利技术，所述代谢途径中催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶由来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的β
‑
酮硫解酶基因phaA编码，其序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]根据本专利技术，所述代谢途径中催化乙酰乙酰辅酶A生成3
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羟基丁酰辅酶A的酶由来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB编码，其序列如SEQ ID No.4所示。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供了所述的大肠杆菌基因工程菌的应用，用于以葡萄糖或木糖为碳源，发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯。
[0014]本专利技术的第三个方面，提供了一种聚3羟基丁酸乳酸酯的生产方法，所述方法是通过发酵上述的大肠杆菌基因工程菌而实现。
[0015]本专利技术的第四个方面，提供了一种催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶，用于由丙酮酸合成聚3羟基丁酸乳酸酯的代谢途径，其中：
[0016]所述催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF编码，或由来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot编码。
[0017]根据本专利技术的优选实施例，所述来源于厚壁菌(Firmicutes bacteriumCAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF的序列如SEQ ID No.2所示；所述来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot的序列如SEQ IDNo.1所示。
[0018]本专利技术具有以下有益效果：
[0019]1、本专利技术通过在大肠杆菌中构建由丙酮酸合成P(3HB
‑
co
‑
LA)的代谢途径，并经过筛选，成功获得了能够在代谢途径中催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶，分别由来源于厚壁菌(Firmicutes bacteriumCAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF编码，以及由来源于乳酸厌氧菌(Clostridiumlactatifermentans)的3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌是以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌株，在其基因组中构建了由丙酮酸合成聚3羟基丁酸乳酸酯的代谢途径，其特征在于：所述代谢途径中，催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF编码，或由来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot编码。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述来源于厚壁菌(Firmicutes bacterium CAG:466)的乙酰辅酶A转移酶基因YdiF的序列如SEQ IDNo.2所示。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述来源于乳酸厌氧菌(Clostridium lactatifermentans)的3
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酮酸辅酶A转移酶基因scot的序列如SEQ ID No.1所示。4.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述代谢途径中通过3
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羟基丁酰辅酶A和乳酰辅酶A合成聚3羟基丁酸乳酸酯的PHA合成酶为来源于荧光假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens strain 2P24)的编码PHA合成酶的基因phaC经过突变后基因phaCm，其序列如SEQ ID No.5所示。5.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述代谢途径中催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶由来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutroph...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴辉，张冰浩，罗远婵，孙欣晔，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：