一种多酶联产催化合成海藻糖的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术于生物技术领域，具体涉及一种多酶联产催化合成海藻糖的枯草芽孢杆菌及其应用。其通过在枯草芽孢杆菌中同时表达普鲁兰酶、海藻糖合酶、海藻糖水解酶的方法，实现了这三种酶在同一个菌株中不同强度的表达。具体地将普鲁兰酶基因表达元件插入至枯草芽孢杆菌基因组中表达，海藻糖合酶与海藻糖水解酶分别用不同的质粒表达的重组菌株其海藻糖转化率与基因组上未整合普鲁兰酶基因的重组菌株提高23%，为进一步实现三个酶的稳定表达，将海藻糖合酶和海藻糖水解酶表达元件插入至枯草芽孢杆菌基因组中表达。杆菌基因组中表达。

【技术实现步骤摘要】
一种多酶联产催化合成海藻糖的枯草芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体是使用枯草芽孢杆菌同时表达海藻糖合酶、海藻糖水解酶和普鲁兰酶合成制造海藻糖的方法

技术介绍

[0002]海藻糖由两个葡萄糖基通过α
‑
1,1糖苷键连接形成，其作为一种安全、稳定的天然二糖，素有“生命之糖”的美誉，被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。
[0003]海藻糖生物合成法包括磷酸化酶法、单酶法、双酶法。双酶法合成海藻糖的途径中主要需要两种酶，麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，是以淀粉为底物制备海藻糖的两个关键酶。专利文献CN99123896.6公开了最适温度50℃和最适pH6.0的MTSase和MTHase，转化率可达到80％，日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。
[0004]枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的不产内毒素的一种食品安全菌种。专利文献CN103215300 A将海藻糖合成酶整合至枯草芽孢杆菌基因组中合成海藻糖，专利文献CN 111218467 B公开了一种高效同步分泌表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的枯草芽孢杆菌，使用spyCatcher和spyTag实现了MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌基因组上高效分泌表达和两个级联酶的体外组装，使海藻糖的转化效率提高至81.5％。
[0005]在国际上海藻糖的需求量处于供不应求的状态，截至2015年，国内仅保鲜市场对海藻糖的需求就有10万t/a，2022年全球海藻糖市场销售额达到了14亿美元，预计2029年将达到23亿美元，且随着海藻糖的不断宣传和普及，海藻糖的需求量还会不断攀升，寻求更简单高效的合成海藻糖是国内外企业不断创新的目标。

技术实现思路

[0006]基于现有技术的需求，本专利技术通过研究探索，构建了一种多酶联产催化合成海藻糖的枯草芽孢杆菌及其应用。
[0007]本专利技术提供一种多酶联产催化合成海藻糖的重组枯草芽孢杆菌，其通过基因重组使得所述重组枯草芽孢杆菌可同时表达普鲁兰酶与海藻糖合酶和水解酶三种酶。
[0008]优选地，所述三种酶是分泌表达至胞外。
[0009]更优选地，所述三种酶整合至枯草芽孢杆菌出发菌株的基因组上。具体地，在nprB位点插入所述海藻糖合成酶的基因和ytxE位点插入所述海藻糖水解酶的基因，或在nprB位点插入所述海藻糖水解酶的基因和ytxE位点插入所述海藻糖合成酶的基因。
[0010]另外优选地，普鲁兰酶整合至基因组，海藻糖合酶和水解酶通过质粒表达，具体地采用且表达海藻糖合酶所用的启动子弱于表达海藻糖水解酶的启动子，具体采用pHT43载体表达的海藻糖合酶，其受p43启动子启动表达，且采用PMA0911载体表达的海藻糖水解酶，其受T7启动子表达。其中，T7启动子是强启动子，p43启动子是弱启动子，实现了这三种酶在
同一个菌株中不同强度的表达。
[0011]更具体地，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如CN102120971B中SEQ ID NO：2所示(在本专利技术中也是SEQ ID NO：2)；所述海藻糖合成酶的NCBI登录号为AB045141.1中第743bp
‑
3016bp位；所述海藻糖水解酶的NCBI登录号为AB045141.1中第3013bp
‑
4740bp位。
[0012]质粒表达或基因组表达的海藻糖合酶和水解酶其N端连接有普鲁兰酶的CBM68结合结构域(其编码核苷酸序列1bp
‑
402bp，如SEQ ID NO：1所示)。
[0013]在一个实施方式中，枯草芽孢杆菌出发菌株是枯草芽孢杆菌SCK6菌株。
[0014]本专利技术提供所述的重组枯草芽孢杆菌在催化合成海藻糖中的应用。
[0015]具体地，取所述重组枯草芽孢杆菌发酵产生的粗酶液添加至麦芽糊精底物中，pH5
‑
7，于40
‑
55℃水浴反应36
‑
72h，终止反应。优选地，所述pH值为6。
[0016]任选地，所述终止反应是100℃煮沸10min终止反应。
[0017]目前，商品化的普鲁兰酶可分为I型和II型，I型普鲁兰酶水解普鲁兰糖、支链淀粉以及其他小分支低聚糖中的α
‑
1,6糖苷键，产物主要是麦芽三糖和一些线性寡糖；II型普鲁兰酶，又名淀粉普鲁兰酶，是一种双功能酶，它除了具有I型普鲁兰酶水解α
‑
1,6糖苷键的脱支功能外，还能够随机水解淀粉和相关线性寡糖直链上的α
‑
1,4糖苷键，具有α
‑
淀粉酶功能。本专利技术人前期发现的普鲁兰酶是中性Ⅰ型普鲁兰酶，具有更专一的底物特异性，更利于双酶法生产海藻糖的反应的进行，避免底物浪费。
[0018]工业生产中使用的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)：选择来自于分枝节杆菌(Athrobacter ramosus)的海藻糖合酶和水解酶，其最适温度为50℃，最适pH为6。目前市场上的普鲁兰酶多为酸性，最适反应pH 4.5
‑
pH 5.0，本专利技术使用的普鲁兰酶最适反应温度为60℃，最适反应pH为pH6.0，温度和pH与现有技术中酶活较高的海藻糖合酶和海藻糖水解酶具有最相似的反应温度和反应pH。其次，本专利技术通过将普鲁兰酶整合至枯草芽孢杆菌基因组中，实现了普鲁兰酶与海藻糖合酶和水解酶三种酶在同一个菌株中同时表达，因海藻糖水解酶是合成海藻糖的关键酶，其与海藻糖合酶之间的配合是一个复杂的过程，本专利技术通过使用不同表达强度的启动子来调节海藻糖合酶与水解酶的表达强度，从而得到两者配合海藻糖最佳的转化效率。
[0019]且该重组枯草芽孢杆菌表达的酶均分泌至胞外，节省了发酵成本和发酵时间。
[0020]本专利技术进一步的将海藻糖合成过程中的三个酶整合至枯草芽孢杆菌基因组不同位点，克服了在长期发酵生产过程中的质粒传代稳定性的问题，更有利于长期的传代培养和发酵生产。
附图说明
[0021]图1、枯草芽孢杆菌SCK6同时表达MTSase、MTHase和普鲁兰酶SDS
‑
PAGE电泳图。
[0022]其中，1：SCK6/pMC68
‑
ARS/pHT43
‑
C68
‑
ARH、2：amyE::pulA SCK6/pMC68
‑
ARS/pHT43
‑
C68
‑
ARH、3：SCK6/pHT43
‑
C68
‑
ARS/pMC68
‑
ARH、4：amyE::pulA SCK6/pHT43
‑
C68
‑
ARS/pMC68
‑
ARH。
[0023]图2、海藻糖合成转化率对比图。其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多酶联产催化合成海藻糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，通过基因重组使得所述重组枯草芽孢杆菌可同时表达普鲁兰酶与海藻糖合酶和水解酶三种酶。2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述三种酶是分泌表达至胞外。3.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述三种酶整合至枯草芽孢杆菌出发菌株的基因组上；或者普鲁兰酶整合至基因组，海藻糖合酶和水解酶通过质粒表达，具体地采用且表达海藻糖合酶所用的启动子弱于表达海藻糖水解酶的启动子，具体采用pHT43载体表达的海藻糖合酶，其受p43启动子启动表达，且采用PMA0911载体表达的海藻糖水解酶，其受T7启动子表达。4.如权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，对于整合至枯草芽孢杆菌出发菌株的基因组上的情况下，在nprB位点插入所述海藻糖合成酶的基因和ytxE位点插入所述海藻糖水解酶的基因，或在nprB位点插入所述海藻糖水解酶的基因和ytxE位点插入所述海藻糖合成酶的基因，amyE位点插入所述普鲁兰酶的基因。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：付晓平，郑宏臣，柏文琴，宋诙，杨俊，徐健勇，甄杰，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：