一种靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向识别切割多耐药基因的工程菌及其构建方法与应用，所述工程菌是以益生菌EcN为底盘菌，整合I

【技术实现步骤摘要】
一种靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌及其构建方法与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及基因编辑与耐药防控领域，具体涉及一种利用I
‑
E型CRISPR系统靶向识别切割多种耐药基因的防控耐药工程菌、构建方法及提高此防控耐药工程菌工作效率的优化方法。
(二)
技术介绍

[0002]细菌耐药性指细菌对于抗菌药物的耐受性。在抗生素的选择性压力下，耐药菌株将不断生长繁殖，使得细菌耐药性提高，随着免疫抑制剂、抗生素等药物的广泛使用，细菌可以出现多种耐药性，并且其性质不断增强，趋于形成多重耐药、高度耐药的形式。细菌多重耐药性(Multi
‑
drug resistance，MDR)是指细菌对多种作用机制不同的抗菌药物产生的耐药性。
[0003]为了应对日渐恶化的细菌耐药性所带来的危害，最常见的方法就是针对致病原合理用药，以及开发新型抗生素，但是抗生素药物的研发存在速度慢、效率低、研发成本高等问题。CRISPR
‑
Cas系统能够靶向并消除耐药基因，使耐药菌恢复对抗生素的敏感性，如利用存在于大肠杆菌BW25113中CRISPR
‑
Cas系统，发挥靶向消减耐药质粒、耐药基因或其转录产物等。目前主要利用II型CRISPR
‑
Cas系统进行基因编辑，消减耐药基因，II型CRISPR
‑
Cas系统由化脓性链球菌改编而来，其编码的Cas9蛋白相对较大，对细胞的负担也更大，且存在诸多脱靶的问题。
[0004]I型CRISPR
‑
Cas系统作用效率高，风险小，操作简便，能够一次靶向更长乃至更多的基因序列，实现新的编辑效果和建立新兴的基因编辑工具，但是开发利用I
‑
E型CRISPR
‑
Cas研究较少。
[0005]E.coli Nissle 1917(EcN)是一种代表性益生菌，主要应用于治疗肠道炎症、改善结肠炎，调节肠道微生物群并拮抗病原体的定植。EcN因其安全性和可遗传操作性，逐渐成为体内活菌治疗的首选底盘微生物。EcN作为工业底盘菌的应用也大量涌现。然而，EcN能够自主接收外源耐药基因，可积蓄和传播耐药基因，存在一定的安全隐患。
[0006]EcN中不存在天然的CRISPR
‑
Cas系统，不具备消减耐药基因的能力，本专利通过在EcN中异源表达I
‑
E型CRISPR
‑
Cas系统，发挥同时靶向并消除多个耐药基因，增加EcN底盘菌在活菌治疗药物和工业生产底盘菌的安全性。
(三)
技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌及其构建方法与应用，首次在EcN中表达I
‑
E型CRISPR
‑
Cas系统，构建出可减少耐药基因积累的工程菌，不仅能够提供抑制肠道多重耐药基因的安全有效微生物活菌制剂，而且还使得EcN具有开发基因编辑工具的潜力。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，所述工程菌是以E.coli Nissle 1917(EcN)为底盘菌，整合I
‑
E型CRISPR
‑
Cas系统；所述I
‑
E型CRISPR/Cas系统由具有核酸酶功能的Cas3蛋白的编码基因cas3和可与CRISPR RNA(crRNA)结合的Cascade蛋白复合体编码基因cas操纵子以及可表达沉默耐药基因crRNA的DNA序列(CR
MNT
)三部分组成；所述Cas3蛋白的编码基因cas3和Cascade蛋白的编码基因cas操纵子由阿拉伯糖诱导启动子P
BAD
表达，所述CR
MNT
通过启动子P
J23100
表达；所述阿拉伯糖诱导启动子P
BAD
基因序列如SEQ ID NO.1所示，cas3基因序列如SEQ ID NO.2所示，cas操纵子基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述CR
MNT
由可变的间隔(spacer)序列和保守序列组成，所述可变的间隔(spacer)序列是指所要靶向的耐药基因同源片段，所述保守序列是指CRISPR
‑
Css系统本身的天然序列。
[0010]CRISPR系统通过识别PAM进而决定整合至CR
MNT
阵列中的可变的间隔(spacer)序列过程并与Cascade形成复合体招募Cas3蛋白对耐药基因进行切割。
[0011]优选的，所述多重耐药基因包括多黏菌素耐药基因mcr
‑
1、β
‑
内酰胺类抗生素bla
NDM
‑1或替加环素耐药基因tet(X6)。
[0012]优选的，所述CR
MNT
基因序列是将多重耐药基因PAM位点后32bp序列作为间隔序列，设计至保守序列中，人工合成CR
MNT
基因，最优选CR
MNT
基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术所述EcN工程菌按如下方法构建：首先将cas3、CR
MNT
与启动子P
BAD
和启动子P
J23100
构建成质粒pGLO
‑
P
BAD
‑
cas3
‑
P
J23100
‑
CR
MNT
；再将cas操纵子与P
BAD
构建成质粒pSU
‑
P
BAD
‑
cas，并将pGLO
‑
P
BAD
‑
cas3
‑
P
J23100
‑
CR
MNT
和pSU
‑
P
BAD
‑
cas通过电转化法(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，《分子克隆实验指南(第四版)》)导入EcN中，以质粒的形式表达I
‑
E型CRISPR
‑
Cas，获得所述EcN工程菌，将其命名为EcN
‑
V1(图4中A)。
[0014]本专利技术所述EcN工程菌还可以按如下方法构建：将cas3整合至EcN基因组上，并通过阿拉伯糖诱导启动子P
BAD
来进行表达，然后转入表达CR
MNT
的pUC
‑
P
J23100
‑
CR
MNT
和表达cas操纵子的质粒pSU
‑
P
BAD
‑
cas，构建EcN工程菌，将其命名为EcN
‑
V2(图4中C)；或者将cas3和cas操纵子都整合到EcN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述工程菌是以E.coli Nissle 1917为底盘菌EcN，整合I
‑
E型CRISPR
‑
Cas系统；所述I
‑
E型CRISPR/Cas系统由具有核酸酶功能的Cas3蛋白编码基因cas3和可与CRISPR RNA结合的Cascade蛋白复合体编码基因cas操纵子以及可表达沉默耐药基因crRNA的DNA序列CR
MNT
三部分组成；所述cas3和cas操纵子由阿拉伯糖诱导启动子P
BAD
表达，所述CR
MNT
通过启动子P
J23100
表达；所述CR
MNT
由可变的间隔序列和保守序列组成，所述可变的间隔序列是指所要靶向的耐药基因同源片段。2.如权利要求1所述靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述阿拉伯糖诱导启动子P
BAD
基因序列如SEQ ID NO.1所示，cas3基因序列如SEQ ID NO.2所示，cas操纵子基因序列如SEQ ID NO.3所示。3.如权利要求1所述靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述耐药基因包括多黏菌素耐药基因mcr
‑
1、β
‑
内酰胺类抗生素bla
NDM
‑1或替加环素耐药基因tet(X6)。4.如权利要求1所述靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述CR
MNT
基因序列是将多重耐药基因PAM位点后32bp序列作为间隔序列，设计至保守序列中，人工合成CR
MNT
基因。5.如权利要求1或4所述靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述CR
MNT
基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.如权利要求1所述靶向识别切割多耐药基因的EcN工程菌，其特征在于，所述EcN工程菌按如下方法构建：首先将cas3、CR
MNT
与启动子P
BAD
和启动子P
J23100
构建成质粒pGLO
‑
P
BAD
‑
cas3
‑
P
J23100
‑
CR
MNT
；再将cas操纵子与P
B...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，张瑞婷，王晨羽，陈张瑱，茅呈耀，刘芝芝，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：