一种重组大肠杆菌及其在制备酪氨酸血症药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌及其在制备酪氨酸血症药物中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过酪氨酸解氨酶的筛选及蛋白标签的添加构建了一株重组工程菌株，具体地，利用基因查找的手段，收集自然界中具有酪氨酸降解活性的酶分子，并对其酪氨酸降解活性进行体外活性检测，筛选得到具有优异活性的酶分子，将筛选出的酶分子转入大肠杆菌中进一步选出高表达酪氨酸解氨酶分子且具有高效降解酪氨酸能力的工程菌，然后为提高降解活性引入蛋白标签，发现其对肠胃液的耐受性也有所提高，有望用于制备酪氨酸血症治疗药物。用于制备酪氨酸血症治疗药物。用于制备酪氨酸血症治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌及其在制备酪氨酸血症药物中的应用


[0001]本专利技术涉及一种重组大肠杆菌及其在制备酪氨酸血症药物中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]酪氨酸血症(tyrosinemia)是由于酪氨酸代谢途径中的酶缺陷，引起的血浆中酪氨酸浓度增高，不同步骤的酶的缺陷可导致多种临床表现不同的疾病，如导致脑、肝、肾、骨骼等多脏器损害，预后不良，致死及致残率很高。酪氨酸在人体的来源包括饮食摄入和内源性合成两部分，内源性生成的底物来源为食源性的必需氨基酸酪氨酸。酪氨酸血症分为3种类型。
[0003]酪氨酸血症Ⅰ型，也被称为肝肾酪氨酸血症(hepatorenal tyrosinemia，HT
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1)，为延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)缺陷所致，以肝、肾和周围神经病变为特征。HT
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1影响男性和女性的数量相等，总体发病率为1/2000～1/100000。美国人群的突变携带频率1/150～1/100，由于奠基者效应，斯堪的纳维亚半岛HT
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1型的活产新生儿发病率约为1/74 000，芬兰和挪威约为1/60 000。此外，在加拿大的魁北克省，活产新生儿发病率约为1/16 000，携带频率约为1/66。据估计，魁北克省Saguenay
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Lac Saint
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Jean地区的新生儿患病率为1/1850。根据HT
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1患者发病年龄，临床上将该疾病分为急性型(发病年龄<2个月)、亚急性型(发病年龄2
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6个月)和慢性型(发病年龄>6个月)。急性患儿多在出生后2个月内急性发病，病情迅速恶化，常在出生后第3
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9月死于肝功能衰竭。亚急性型与急性型相似，但症状出现在出生后2
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6个月之间。慢性型发病时间通常在出生6个月之后，临床表现以渐进性肝和肾损害为主，随着病情的发展最终会导致肝硬化和Fanconi综合征，甚至出现佝偻病。FAH酶缺乏会导致有毒代谢物的积累，包括延胡索酰乙酰乙酸(FAA)和马来酸乙酰乙酸(maleylacetoacetate)。由于其上游代谢物酪氨酸(tyrosine)、4
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羟基苯丙酮酸(4
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hydroxyphenylpyruvate)含量升高，使中间代谢产物马来酰乙酰乙酸进一步积累，从而刺激产生旁代谢通路，导致其代谢产物琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate)、琥珀酰丙酮增高(succinylacetone，SA)。这两种旁代谢产物可以与蛋白质的巯基结合，是造成肝肾损害的主要原因。当不接受治疗时，大多数HT
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1患者在婴儿早期就会死于急性严重肝肾功能衰竭。酪氨酸血症Ⅱ型，为酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransferase，TAT)缺陷所致，以角膜增厚、掌跖角化和发育落后为特征。酪氨酸血症Ⅲ型，极为罕见，为4
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羟基苯丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase，HPPD)缺陷所致，以神经精神症状为主要表现。
[0004]目前针对酪氨酸血症存在唯一一款上市药物——尼替西农(NTBC)。NTBC是4
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羟基苯丙酮酸双加氧酶的竞争性抑制剂，可抑制HT
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1患者体内酪氨酸的常规分解代谢，阻止毒性代谢产物在体内蓄积，从而避免肝肾功能损害，提高患者存活率。患者在尼替西农治疗期间必须限制饮食中酪氨酸和酪氨酸摄入量。研究中报告的常见不良反应为血小板减少、白细胞减少和视觉系统病症，包括结膜炎、角膜混浊、角膜炎和畏光。但由于NTBC为4
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羟基苯
丙酮酸双加氧酶抑制剂，抑制了酪氨酸向4
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羟基苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过500μmol/L，需要控制蛋白质摄入，给予不含酪氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗，否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。
[0005]其他HT
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1的治疗方法包括肝移植及基因治疗。肝移植治疗HT
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1已有20多年历史，可显著改善患者的肝脏、肾脏及神经系统症状。近几年随着NTBC的应用需要肝移植者逐渐减少。另外，肝移植术后患儿仍有约5％
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10％的病死率，且术后仍需终生进行免疫抑制治疗，且此方法受手术条件及供体数量少的限制，临床上应用存在困难，故只有当患儿肝功能严重衰竭，且对尼替西农治疗无效或由于其他原因得不到尼替西农治疗及肝组织有发生恶变的依据时，选择肝移植治疗。至于基因治疗目前仍处于动物研究阶段。
[0006]本专利技术旨在通过开发活体微生物药物从食源性代谢的角度对此疾病进行治疗，目前尚未有相关的报道。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，通过引入来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)的酪氨酸解氨酶FjTAL实现全菌体的降解活性保持，并进一步融合表达蛋白标签，筛选得到酪氨酸降解效果最优的结构。同时对不同菌株进行肠胃液耐受性实验，发现其中一株工程菌在耐受实验中表现最为优异，为制备酪氨酸血症治疗药物奠定了基础。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种表达酪氨酸解氨酶的重组大肠杆菌，其异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸解氨酶FjTAL，并在酪氨酸解氨酶FjTAL的N端融合表达了蛋白标签。
[0009]进一步地，蛋白标签选自SUMO标签、GST标签或GroE标签。
[0010]进一步地，SUMO标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；GST标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；GroE标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0011]进一步地，酪氨酸解氨酶FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0012]进一步地，以Escherichia coli Nissle1917(EcN1917)为出发菌株。
[0013]进一步地，以pGEX
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4T
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2为表达载体。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0015]S1、将蛋白标签融合至酪氨酸解氨酶FjTAL的N端，并连接至表达载体上，得到重组质粒；
[0016]S2、将S1得到的重组质粒导入大肠杆菌宿主中，得到上述重组大肠杆菌。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在降解酪氨酸中的应用，如制备成降解酪氨酸的产品用于体外或体内降解酪氨酸。
[0018]本专利技术的第四个目的是提供上述重组大肠杆菌在制备酪氨酸血症预防或治疗药物中的应用。
[0019]本专利技术的第五个目的是提供一种可降解酪氨酸的微生物菌剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达酪氨酸解氨酶的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸解氨酶FjTAL，并在所述酪氨酸解氨酶FjTAL的N端融合表达了蛋白标签。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述蛋白标签选自SUMO标签、GST标签或GroE标签。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述SUMO标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GST标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述GroE标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述酪氨酸解氨酶FjTAL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：以Escherichia coliNissle1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立，孔繁智，王斗，程明飞，李浩宇，卢军平，
申请(专利权)人：苏州优信合生技术有限公司，
类型：发明
国别省市：