【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种大肠杆菌无抗生素表达系统及其在高效表达目的基因中的应用。
技术介绍
1、大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，因其遗传背景清晰，易于基因工程操作，繁殖迅速，生长要求低，来源广泛等优点，使其成为利用最为广泛的基因工程菌株，目前已经广泛应用于代谢工程产物以及重组蛋白的生产。ecn是大肠杆菌中唯一一种益生菌，利用ecn益生菌自身的菌体特性，在治疗各种肠胃疾病如溃疡性结肠炎、传染性腹泻等具有良好效果。ecn自身生物安全性加上大肠杆菌的优良特性，在利用ecn生产某些食品级代谢物优于一般大肠杆菌菌株，并且被广泛应用于医药研发中。
2、目前，肠杆菌表达系统中最为主要的原件是质粒载体，大部分的质粒通过抗性筛选标记维持分离稳定性。然而，抗生素的使用会造成耐药菌的出现，会对环境带来负面影响，增加生产成本。同时，质粒上的抗性基因，也会造成基因污染，造成基因突变。在ecn中转入常规抗性质粒，导致ecn的益生菌特性大幅降低，使该菌株在使用范围上极度受限，几乎不能在临床上应用。因此，基于生物安全性益生菌ecn构建无抗生素表达平台具有重要的意义。
3、有研究人员也在致力于开发无抗生素标记的大肠杆菌表达系统。如cn115029365a公开了一种大肠杆菌益生菌ecn无抗生素表达体系，但pmut1和pmut2的改造后质粒虽然不需使用抗生素培养，但是质粒上的抗性基因依然存在，可能有抗性基因污染的风险。而且pmut1和pmut2的生物学作用还未完全研究清楚，对其进行改造，可能会影响菌株的生长发育，削弱ecn的益生菌特性
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术构建了一种大肠杆菌益生菌无抗生素表达系统，以大肠杆菌益生菌ecn为原始菌株，通过生物分子技术在表达载体中引入基因 gutb替换抗性基因，并在特定碳源的培养基中发挥功能，使之能够在无抗生素培养基中正常生长，进而能够高效表达外源基因。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种无抗生素筛选标记筛选大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
3、s1、将表达载体中的抗性基因替换为山梨醇脱氢酶编码基因 gutb，并将得到的重组表达载体导入大肠杆菌宿主菌中；
4、s2、将s1得到的重组大肠杆菌于含有碳源的培养基中培养实现筛选，所述碳源为可被山梨醇脱氢酶降解且降解产物可用于重组大肠杆菌生长的物质。
5、进一步地，所述表达载体优选为质粒。
6、进一步地，所述质粒可为任何适用于大肠杆菌表达的质粒种类，包括但不限于改造或未改造的pcdfduet1质粒、pet质粒、pbad质粒、ptrc质粒、pgex质粒等。本专利技术能够改造目前最广泛应用的大肠杆菌表达载体，所有大肠杆菌类的表达载体均可使用本专利技术进行改造，最终实现菌株在无抗生素条件下的蛋白表达。
7、进一步地，所述大肠杆菌宿主菌为改造或未改造的大肠杆菌。
8、进一步地，所述大肠杆菌宿主菌包括但不限于大肠杆菌nissle 1917或其衍生菌株。
9、进一步地，通过分子生物学技术将抗性基因替换为 gutb基因。优选地，所述分子生物学技术包括聚合酶链式反应（pcr）、琼脂糖凝胶电泳、同源重组、限制性内切酶酶切、质粒转化等。
10、进一步地，所述山梨醇脱氢酶可来源于任何含有该酶且能在大肠杆菌中实现异源表达的物种，应包括所有枯草芽孢杆菌属以及其余菌属的同源基因或人工优化序列，如萎缩芽胞杆菌globigii亚种（ bacillus atrophaeus subsp. globigii）、贝莱斯芽胞杆菌（ bacillus velezensis）、枯草芽胞杆菌沙漠亚种（ bacillus inaquosorum）等。
11、进一步地，山梨醇脱氢酶编码基因 gutb的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12、进一步地，所述碳源包括但不局限于山梨醇、木糖醇、艾杜醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露醇等，以及基因 gutb直接或潜在可以降解的物质或者是这些物质的任意组合。
13、进一步地，培养基中上述碳源浓度为5-20 g/l。
14、本专利技术的第二个目的是提供一种无抗生素筛选标记的质粒，所述质粒是采用山梨醇脱氢酶编码基因 gutb替换了抗性基因的质粒。
15、本专利技术的第三个目的是提供一种无抗生素筛选标记的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有上述质粒。
16、进一步地，所述重组大肠杆菌为改造或未改造的大肠杆菌nissle 1917。
17、本专利技术的第四个目的是提供一种大肠杆菌无抗生素表达系统，表达系统包括表达原件、表达菌株和培养体系：
18、所述表达原件中包括重组质粒，所述重组质粒为采用山梨醇脱氢酶编码基因 gutb替换了抗性基因的质粒；
19、所述表达菌株为改造或未改造的大肠杆菌；
20、所述培养体系中包括含有碳源的培养基，所述碳源为可被山梨醇脱氢酶降解且降解产物可用于重组大肠杆菌生长的物质。
21、本专利技术的第五个目的是提供上述质粒、重组大肠杆菌或表达系统在合成生物学领域中的应用。
22、进一步地，所述合成生物学领域应用包括苯丙氨酸解氨酶、橄榄酸合成通路、萜类物质合成通路等。
23、本专利技术的第六个目的是提供上述质粒、重组大肠杆菌或表达系统在制备生物药物（如基因工程疫苗、微生物菌剂等）中的应用。
24、进一步地，基因工程疫苗包括但不限于如下种类：流感疫苗、霍乱疫苗或活菌疫苗载体等；还可以用于制备如下种类的药物：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、青蒿素、glp-1多肽（人胰高血糖素样肽-1）等。
25、进一步地，制备生物药物时，在载体上连接目的基因，所述目的基因为药物有效成分的编码基因和/或成药辅助物质的编码基因。其中，药物有效成分即为上述抗体、多肽等，成药辅助药物可为用于靶向、阻断等用途的物质。
26、本专利技术的第七个目的是提供一种采用大肠杆菌高效表达目的基因的方法，包括以下步骤：
27、s1、将表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无抗生素筛选标记筛选大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主菌为改造或未改造的大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源选自山梨醇、木糖醇、艾杜醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露醇中的一种或几种。
4.一种无抗生素筛选标记的质粒，其特征在于，所述质粒是采用山梨醇脱氢酶编码基因gutB替换了抗性基因的质粒。
5.一种无抗生素筛选标记的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有权利要求4所述的质粒。
6.一种大肠杆菌无抗生素表达系统，其特征在于，表达系统包括表达菌株、与表达菌株匹配的表达原件，以及培养体系：
7.权利要求4所述的质粒、权利要求5所述的重组大肠杆菌或权利要求6所述的表达系统在合成生物学领域或在制备生物药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，制备生物药物时，使用的大肠杆菌为改造或未改造的大肠杆菌Nissle 1917。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，制备生物药物时
10.一种采用大肠杆菌高效表达目的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种无抗生素筛选标记筛选大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主菌为改造或未改造的大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源选自山梨醇、木糖醇、艾杜醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露醇中的一种或几种。
4.一种无抗生素筛选标记的质粒，其特征在于，所述质粒是采用山梨醇脱氢酶编码基因gutb替换了抗性基因的质粒。
5.一种无抗生素筛选标记的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有权利要求4所述的质粒。
6.一种大肠杆菌无抗生素表达系统，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文磊，孔繁智，王斗，王立，郝鑫，程明飞，
申请(专利权)人：苏州优信合生技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。