一种重组肠杆菌及其在降解酪氨酸和苯丙氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组肠杆菌及其在降解酪氨酸和苯丙氨酸中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过基因查找手段，收集自然界中同时具有苯丙氨酸及酪氨酸降解活性的酶分子，并对其苯丙氨酸及酪氨酸降解活性进行体外活性检测，筛选得到具有优异活性的酶分子，将筛选出的酶分子转入肠杆菌中，进一步选出高表达酶分子且具有高效降解苯丙氨酸与酪氨酸能力的工程菌，然后为提高降解活性引入蛋白标签。最后通过肠胃液的耐受性实验筛选得到最优结构，得到了远高于现有降解活性的一株工程菌，有望用于制备苯丙酮尿症与酪氨酸血症治疗药物。用于制备苯丙酮尿症与酪氨酸血症治疗药物。用于制备苯丙酮尿症与酪氨酸血症治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
一种重组肠杆菌及其在降解酪氨酸和苯丙氨酸中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种重组肠杆菌及其在降解酪氨酸和苯丙氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]苯丙酮尿症(Phenylketonuria)，简称PKU，是先天性氨基酸代谢障碍中最常见疾病，也是一种常染色体隐性遗传病，因苯丙氨酸羟化酶基因突变，导致酶活性降低，苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积导致的疾病。一般在出生后3
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6个月开始出现症状，临床表现有智力、运动发育落后、皮肤毛发色素减少、鼠尿臭味等。如果未得到及时治疗，高量的苯丙氨酸累积会引起较为严重的医学问题，例如癫痫发作、智力障碍等。
[0003]目前，常见治疗苯丙酮尿症的药物大多是化学药物，存在较高的毒副作用、容易产生耐药性等缺点，生物药物中，现阶段治疗PKU的特效药是注射PEG修饰后的重组PAL蛋白（PEG
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PAL，聚乙二醇缀合的苯丙氨酸解氨酶），可以将人血浆中的苯丙氨酸浓度降低至较为安全的浓度水平，但PEG
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PAL会引起较为严重的免疫反应；不同于PEG
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PAL侵入性制剂及治疗方法，国内外也有口服PAL制剂的研究，口服递送的优势是无免疫排斥反应，但是缺点亦较为明显，口服的PAL会被肠胃内的胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等分解。无论是侵入式注射剂，还是口服式蛋白剂，首要解决的都是在减少药物用量的前提下提高PAL蛋白的催化活性及稳定性，因此天然PAL的定向改造尤为重要。
[0004]酪氨酸血症（tyrosinemia）是由于酪氨酸代谢途径中的酶缺陷，引起的血浆中酪氨酸浓度增高，不同步骤的酶的缺陷可导致多种临床表现不同的疾病，如导致脑、肝、肾、骨骼等多脏器损害，预后不良，致死及致残率很高。酪氨酸在人体的来源包括饮食摄入和内源性合成两部分，内源性生成的底物来源为食源性的必需氨基酸酪氨酸。
[0005]酪氨酸血症Ⅰ型，也被称为肝肾酪氨酸血症（hepatorenal tyrosinemia，HT
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1），为延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）缺陷所致，以肝、肾和周围神经病变为特征。HT
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1影响男性和女性的数量相等，总体发病率为 1/2000~1/100000。美国人群的突变携带频率 1/150~1/100，由于奠基者效应，斯堪的纳维亚半岛HT
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1型的活产新生儿发病率约为 1/74 000，芬兰和挪威约为 1/60 000。此外，在加拿大的魁北克省，活产新生儿发病率约为 1/16 000，携带频率约为1/66。 据估计，魁北克省 Saguenay
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Lac Saint
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Jean 地区的新生儿患病率为 1/1850。根据 HT
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1患者发病年龄，临床上将该疾病分为急性型(发病年龄<2个月)、亚急性型(发病年龄2
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6个月) 和慢性型(发病年龄>6个月) 。急性患儿多在出生后2个月内急性发病，病情迅速恶化，常在出生后第3
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9 月死于肝功能衰竭。亚急性型与急性型相似，但症状出现在出生后2
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6 个月之间。慢性型发病时间通常在出生6个月之后，临床表现以渐进性肝和肾损害为主，随着病情的发展最终会导致肝硬化和范可尼综合征，甚至出现佝偻病。FAH 酶缺乏会导致有毒代谢物的积累，包括延胡索酰乙酰乙酸( FAA) 和马来酸乙酰乙酸( maleylacetoacetate)。由于其上游代谢物酪氨酸( tyrosine)、4
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羟基苯丙酮酸( 4
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hydroxyphenylpyruvate) 含量升高，使中间代谢产物马
来酰乙酰乙酸进一步积累，从而刺激产生旁代谢通路，导致其代谢产物琥珀酰乙酰乙酸( succinylacetoacetate ) 、琥珀酰丙酮增高( succinylacetone，SA)。这两种旁代谢产物可以与蛋白质的巯基结合，是造成肝肾损害的主要原因。当不接受治疗时，大多数 HT
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1 患者在婴儿早期就会死于急性严重肝肾功能衰竭。酪氨酸血症Ⅱ型，为酪氨酸氨基转移酶（tyrosine aminotransferase，TAT）缺陷所致，以角膜增厚、掌跖角化和发育落后为特征。酪氨酸血症Ⅲ型，极为罕见，为4
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羟基苯丙酮酸双加氧酶（hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase，HPPD）缺陷所致，以神经精神症状为主要表现。
[0006]目前针对酪氨酸血症存在唯一一款上市药物
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尼替西农（NTBC）。NTBC是4
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羟基苯丙酮酸双加氧酶的竞争性抑制剂，可抑制HT
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1患者体内酪氨酸的常规分解代谢，阻止毒性代谢产物在体内蓄积，从而避免肝肾功能损害，提高患者存活率。患者在尼替西农治疗期间必须限制饮食中酪氨酸和酪氨酸摄入量。研究中报告的常见不良反应为血小板减少、白细胞减少和视觉系统病症，包括结膜炎、角膜混浊、角膜炎和畏光。但由于NTBC为 4－羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂，抑制了酪氨酸向4－羟基苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过 500 μmol /L，需要控制蛋白质摄入，给予不含酪氨酸、 酪氨酸配方营养粉饮食治疗，否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。
[0007]其他HT
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1的治疗方法包括肝移植及基因治疗。肝移植治疗HT
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1已有20多年历史，可显著改善患者的肝脏、肾脏及神经系统症状。近几年随着NTBC的应用需要肝移植者逐渐减少。另外，肝移植术后患儿仍有约5%
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10％的病死率，且术后仍需终生进行免疫抑制治疗，且此方法受手术条件及供体数量少的限制，临床上应用存在困难，故只有当患儿肝功能严重衰竭，且对尼替西农治疗无效或由于其他原因得不到尼替西农治疗及肝组织有发生恶变的依据时，选择肝移植治疗。至于基因治疗目前仍处于动物研究阶段。
[0008]本专利技术旨在通过开发活体微生物药物从食源性代谢的角度对以上疾病进行治疗，目前尚未有相关的报道。

技术实现思路

[0009]为解决上述问题，本专利技术提供了一种高效表达黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的苯丙氨酸氨酸及酪氨酸解氨酶PcXAL的重组肠杆菌，其实现了全菌体的降解活性保持。同时对添加不同蛋白标签的工程菌株进行肠胃液耐受性实验，筛选得到苯丙氨酸氨酸及酪氨酸降解效果最优的结构，为制备苯丙酮尿症及酪氨酸血症治疗药物奠定了基础。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供一种重组肠杆菌在制备降解酪氨酸和/或苯丙氨酸产品中的应用，所述重组肠杆菌异源表达了如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并在该氨基酸序列的N端融合表达了蛋白标签。
[0011]进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组肠杆菌在制备降解酪氨酸和/或苯丙氨酸产品中的应用，其特征在于：所述重组肠杆菌异源表达了如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并在该氨基酸序列的N端融合表达了蛋白标签。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白标签选自SUMO标签、GST标签或GroE标签。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述SUMO标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述GST标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GroE标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：以大肠杆菌为出发菌株。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立，孔繁智，王斗，董雨萌，王文磊，程明飞，
申请(专利权)人：苏州优信合生技术有限公司，
类型：发明
国别省市：