一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，涉及基因工程领域。所述制备方法利用重组大肠杆菌表达含多种生物活性肽结构的串联肽，该串联肽结构符合特定公式。串联肽经过硫酸铵沉淀法纯化或镍柱纯化，再通过蛋白酶水解获得单体肽混合液。单体肽混合溶液经过等电点分级沉淀，分别获得相应的生物活性肽。该法可同时制备生物活性肽GHK和Caseicin B，也可同时制备生物活性肽Darobactin A、Darobactin B和Pug

【技术实现步骤摘要】
一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法。具体是利用重组大肠杆菌表达含多种生物活性肽结构的串联肽，再通过蛋白酶水解串联肽，经等电点分级沉淀，同时制备多种生物活性肽的方法。

技术介绍

[0002]生物活性肽具有显著的生物活性和生物安全性，并广泛应用于医药、化妆品和食品等相关领域，对提高人类的生活质量有很大帮助。具体的，生物活性肽具有抗血栓、抗氧化、抗衰老和抗菌等功能。
[0003]Caseicin B是由干酪素钠发酵产生的生物活性肽，对Cronobacter sakazakii、Escherichia coli、Listeria innocua和Streptococcus mutans等细菌具有抗菌性(Appl.Environ.Microbiol，2006，72：2260
‑
2264)，目前以微波辅助固相多肽合成法(MW
‑
SPPS)进行制备(Appl.Environ.Microbiol，2011，77：2496
‑
2501)。
[0004]CHK是发现自人血浆的一种三肽，具有促进神经元细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、肥大细胞、纤维母细胞和淋巴细胞的生长(Amino Acids，1997，13：155
‑
161)，此外还对Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa和Candida albicans具有抗菌活性(Int J Pept Res Ther，2015，21：21
‑
28)。
[0005]Darobactin A和Darobactin B是两种7肽，可选择性杀死革兰氏阳性菌，它们作用的靶点均为外膜蛋白BamA(Microbiol Spectr，2021，9：e0153521)。目前，Darobactin A和Darobactin B分别由Photorhabdus khani外源表达制备获得。
[0006]Pug
‑
3是一种具有抑制Streptococcus mutans黏附作用的4肽，此外，其还能抑制人类角质细胞HaCaT细胞的生长(Lett Appl Microbiol，2020，70：151
‑
158)。
[0007]目前制备生物活性肽的方法主要有以下几种：水解法，以牛奶、动物肉类、玉米、小麦、大豆和鸡蛋等为原料，进行酶水解或微生物发酵降解，获得相关生物活性肽；化学合成，以各种氨基酸为原料，通过液相法、固相法或液相固相混合法合成生物活性肽；基因工程法，通过微生物外源表达目的生物活性肽基因制备相应的生物活性肽。水解法优点在于原料来源简单便宜，成本低，但水解产物杂质多，特定生物活性肽收率低。化学合成法过程中需要对氨基酸进行保护和脱保护，收率低且环境不友好。基因工程法具有目的生物活性肽产量大、易纯化的优点，但在短肽制备方面的应用较少。目前有通过多拷贝串联DNA的克隆技术来生产短肽，其中李爽等在专利申请CN112608933A中利用大肠杆菌工程菌表达串联短肽，再经酶切制备GHK。但目前还未有一种利用基因工程技术，同时制备多种生物活性肽的方法。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术通过构建大肠杆菌工程菌来表达串联多
肽序列，可以同时制备获得两种或两种以上不同的生物活性肽。
[0009]本专利技术提供如下的技术方案：
[0010]一种串联肽，为[P
1 P2]n
、[P1]n1
‑
[P2]n2
、His
‑
tag
‑
A
‑
[P
1 P2]n
、His
‑
tag
‑
A
‑
[P1]n1
‑
[P2]n2
、[P
1 P
2 P3]m
、[P1]m1
‑
[P2]m2
‑
[P3]m3
、His
‑
Tag
‑
A
‑
[P
1 P
2 P3]m
或His
‑
tag
‑
A
‑
[P1]m1
‑
[P2]m2
‑
[P3]m3
。
[0011]其中n为20～30之间的整数且包含20和30，n1和n2为9～60之间的整数且包含9和60。
[0012]m为15～20之间的整数且包含15和20，m1、m2和m3为10～40之间的整数且包含10和40。
[0013]His
‑
tag为组氨酸标签，A为一个氨基酸残基，且选自Lys、Arg、Phe、Tyr或Trp。
[0014]P1、P2和P3为氨基酸残基数为3～8之间且包含3和8的生物活性肽，P1、P2和P3的C端氨基酸残基选自Lys、Arg、Phe、Tyr或Trp，在P1、P2和P3序列中的其它剩余氨基酸残基均不与C端氨基酸残基相同，同时P1、P2和P3的等电点pI值相互之间的差值≥2。
[0015]本专利技术提供了一种表达所述串联肽的载体。
[0016]本专利技术提供了一种含有表达串联肽的载体的重组菌株，所述重组菌株优选为大肠杆菌。更为优选为pET
‑
28a(+)、pET
‑
30a(+)或pET
‑
32a(+)等。
[0017]本专利技术提供了一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，构建大肠杆菌工程菌表达串联多肽序列，所表达的串联多肽分别经过硫酸铵沉淀或镍柱纯化、蛋白酶酶切和等电点分级沉淀，同时制备获得多种生物活性肽。
[0018]在一个优选的技术方案中，本专利技术采用如下技术方案：
[0019]一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，包括步骤：
[0020](1)以2种以上生物活性肽氨基酸序列为基础设计串联肽序列；
[0021](2)构建串联肽序列重组表达载体；
[0022](3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建表达串联肽的重组大肠杆菌；
[0023](4)培养重组大肠杆菌，并诱导其表达串联肽；
[0024](5)培养产物离心取菌体，破碎菌体，取破碎液上清；
[0025](6)破碎上清进行硫酸铵沉淀或镍柱纯化，获得纯化串联肽或串联肽溶液；
[0026](7)蛋白酶酶切串联肽，获得单体肽；
[0027](8)等电点分级沉淀，分别制备得到各生物活性肽。
[0028]优选的，所述生物活性肽为2或3种。
[0029]其中，优选的，步骤(1)中所述串联肽序列需满足以下通式之一：[P
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种串联肽，为[P
1 P2]
n
、[P1]
n1
‑
[P2]
n2
、His
‑
tag
‑
A
‑
[P
1 P2]
n
、His
‑
tag
‑
A
‑
[P1]
n1
‑
[P2]
n2
、[P
1 P
2 P3]
m
、[P1]
m1
‑
[P2]
m2
‑
[P3]
m3
、His
‑
Tag
‑
A
‑
[P
1 P
2 P3]
m
或His
‑
tag
‑
A
‑
[P1]
m1
‑
[P2]
m2
‑
[P3]
m3
，其中：P1、P2和P3为氨基酸残基数为3～8之间且包含3和8的生物活性肽，P1、P2和P3的C端氨基酸残基选自Lys、Arg、Phe、Tyr或Trp，在P1、P2和P3序列中的其它剩余氨基酸残基均不与C端氨基酸残基相同，同时P1、P2和P3的等电点pI值相互之间的差值≥2，n为20～30之间的整数且包含20和30，n1和n2为9～60之间的整数且包含9和60，m为15～20之间的整数且包含15和20，m1、m2和m3为10～40之间的整数且包含10和40，His
‑
tag为组氨酸标签，A为一个氨基酸残基，且选自Lys、Arg、Phe、Tyr或Trp。2.一种表达权利要求1所述的串联肽的载体。3.一种含有权利要求2所述的表达串联肽的载体的重组菌株，所述重组菌株优选为大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，为pET
‑
28a(+)、pET
‑
30a(+)或pET
‑
32a(+)。5.一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以2种以上生物活性肽氨基酸序列为基础设计权利要求1所述的串联肽序列；(2)构建串联肽序列重组表达载体；(3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建表...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴保中，胡海峰，岑昊聪，
申请(专利权)人：安徽普利药业有限公司，
类型：发明
国别省市：