一种多肽、融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于蛋白可溶性表达的多肽、包含该多肽的融合蛋白及其应用。所述多肽包括4～6种氨基酸，所述氨基酸包括：选自甘氨酸(G)、脯氨酸(P)和丙氨酸(A)中的2或3种；和选自苏氨酸(T)、丝氨酸(S)和谷氨酸(E)中的2或3种；且所述多肽的空间结构具有至少20％的α螺旋。所述融合蛋白包括所述的多肽及目的蛋白。本发明专利技术提供的具有特定氨基酸组成及特定二级结构的多肽，可显著提高融合蛋白的可溶性表达水平，同时可延长药物蛋白的半衰期，并能最大程度地保留蛋白的生物活性。大程度地保留蛋白的生物活性。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽、融合蛋白及其应用
[0001]本申请要求申请日为2022/01/06的中国专利申请2022100101473的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。


[0002]本专利技术属于生物
，涉及一种用于蛋白可溶性表达的多肽、含其的融合蛋白及所述多肽的应用。

技术介绍

[0003]目前应用广泛的表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、CHO哺乳动物细胞表达系统以及昆虫细胞表达系统。其中，大肠杆菌因为具有生长快、培养成本低、遗传背景清楚和易于实现高密度发酵培养等优点，已应用于很多具有重要药用价值的蛋白生产，尤其适用于表达原核来源的蛋白质以及那些不需要翻译后修饰的真核蛋白。
[0004]在使用高效的大肠杆菌表达系统时，过量表达的重组蛋白常会在细胞内凝集，形成无活性的固体包涵体沉淀。包涵体的形成主要是由于在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等。包涵体一般含有50％以上的重组蛋白，其余为核酸、酶类、外膜蛋白以及脂体、脂多糖等，大小为0.5
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1μM，难溶于水。
[0005]包涵体表达虽然有助于获得较高的表达量，但此方式表达出的蛋白存在折叠混乱、二硫键配对错误、无生物活性、变复性条件需要长时间摸索等问题，即使包涵体成功复性，其均一性和活性依然让人质疑。而且，复性过程是一个较为复杂的过程，多数蛋白的复性效率很低，一般蛋白质的复性效率在10
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20％左右(高应瑞,刘珂飞.表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究[J].今日畜牧兽医,2021,37(07))。因此，对于大肠杆菌表达系统来说，开发一个有效的可溶性表达活性生物蛋白的方法，可以极大提高该系统的利用价值和大幅降低重组蛋白的生产成本。
[0006]一般可以通过采用共表达分子伴侣、改善发酵培养条件等方法来提高可溶蛋白在原核表达系统中的比例。从既往经验看来，这些方法所提高的可溶蛋白表达量不是非常明显。也可以采用融合标签表达的方式帮助目标蛋白可溶表达，如谷胱甘肽S
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转移酶(GST)、SUMO、MBP等(马媛媛,何建民,康永杰.外源性蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略综述[J].世界科技研究与发展,2015,37(5):627
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6302)。不过在进行具体应用时，需要将这些标签切掉。
[0007]现有技术缺乏可用于蛋白可溶性表达的多肽或融合蛋白。

技术实现思路

[0008]为解决现有技术中蛋白药物在原核表达系统中可溶性表达比例不高的问题，本专利技术提供一种用于蛋白可溶性表达的多肽、融合蛋白或其应用。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术的方案之一为：提供一种多肽，其包括4～6种氨基酸，所述氨基酸包括：
[0010]选自甘氨酸(G)、脯氨酸(P)和丙氨酸(A)中的2或3种；
[0011]和选自苏氨酸(T)、丝氨酸(S)和谷氨酸(E)中的2或3种；
[0012]且所述多肽的结构具有至少20％的α螺旋。本专利技术中α螺旋的占比根据GORI算法计算获得。
[0013]在一些优选的实施例中，所述多肽的空间结构具有至少30％、50％、60％、70％、80％或90％的α螺旋。
[0014]在一些优选的实施例中，所述多肽包括10～300个氨基酸；优选20～100个氨基酸；更优选30～60个氨基酸。
[0015]在一些优选的实施例中，所述多肽包括10～200个氨基酸、10～100个氨基酸、10～50个氨基酸，或20～300个氨基酸、20～200个氨基酸、20～50个氨基酸，或30～300个氨基酸、30～200个氨基酸、30～100个氨基酸、30～50个氨基酸。
[0016]在一些优选的实施例中，所述多肽包括10个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸、40个氨基酸、50个氨基酸、60个氨基酸、70个氨基酸、80个氨基酸、90个氨基酸、100个氨基酸、110个氨基酸、120个氨基酸、130个氨基酸、140个氨基酸、150个氨基酸、160个氨基酸、170个氨基酸、180个氨基酸、190个氨基酸、200个氨基酸、210个氨基酸、220个氨基酸、230个氨基酸、240个氨基酸、250个氨基酸、260个氨基酸、270个氨基酸、280个氨基酸、290个氨基酸或300个氨基酸。
[0017]在一些更优选的实施例中，所述多肽中的氨基酸选自以下组：
[0018](1)A、T、S和E；
[0019](2)P、A、S和E；
[0020](3)G、A、S和E；
[0021](4)G、P、S和E；
[0022](5)G、A、T、S和E；
[0023](6)P、A、T、S和E；
[0024](7)G、P、A、T、S和E。
[0025]在一些优选的实施例中，所述氨基酸具有4～30个重复单元。
[0026]在一些优选的实施例中，所述氨基酸具有5～25个重复单元。
[0027]在一些优选的实施例中，所述氨基酸具有10～25个重复单元。
[0028]在一些优选的实施例中，所述氨基酸具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个重复单元。
[0029]在一些具体的实施例中，所述重复单元中不超过4个连续氨基酸残基是相同的。
[0030]在一些具体的实施例中，所述重复单元中不超过3个连续氨基酸残基是相同的。
[0031]在一些优选的实施例中，所述重复单元包括AA、TT、SS、EE、GG、PP、AAA、TTT、SSS、EEE和GGG中的一种或多种。
[0032]在一些具体的实施例中，所述重复单元包括AA、EE、SS、TT、AAA和EEE。
[0033]在一些具体的实施例中，所述重复单元包括AA、EE、SS、TT、PP、AAA、EEE、和SSS。
[0034]在一些具体的实施例中，所述重复单元包括AA、EE、SS、TT、PP、AAA、EEE、SSS和TTT。
[0035]在一些具体的实施例中，所述重复单元包括AA、EE、SS、TT、EEE、PP和SSS。
[0036]在一些优选的实施例中，所述多肽包括以下氨基酸序列：
[0037]PAAEESSTTEEAX1ASSPEEE(SEQ ID NO:27)，其中X1代表A或E；或，GAAEESS(SEQ ID NO:28)、EEAAASSGEEE(SEQ ID NO:73)、AAGGSSSE(SEQ ID NO:74)。
[0038]在一些优选的实施例中，所述多肽包括如SEQ ID NO:1～26所示的氨基酸序列
[0039]在一些更优选的实施例中，所述多肽包括以下氨基酸序列：
[0040](1)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:23；或，
[0041](2)S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，其包括4～6种氨基酸，所述氨基酸包括：选自甘氨酸(G)、脯氨酸(P)和丙氨酸(A)中的2或3种；和选自苏氨酸(T)、丝氨酸(S)和谷氨酸(E)中的2或3种；且所述多肽的空间结构具有至少20％的α螺旋。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的空间结构具有至少30％、50％、60％、70％、80％或90％的α螺旋；和/或，所述多肽包括10～300个氨基酸；优选20～100个氨基酸；更优选30～60个氨基酸。3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸选自以下组：(1)A、T、S和E；(2)P、A、S和E；(3)G、A、S和E；(4)G、P、S和E；(5)G、A、T、S和E；(6)P、A、T、S和E；(7)G、P、A、T、S和E。4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有4～30个重复单元，优选5～25个重复单元，更优选10～25个重复单元；例如具有5、10、11、12、15、20、25、30个重复单元；较佳地，所述重复单元中不超过4个连续氨基酸残基是相同的；更佳地，所述重复单元中不超过3个连续氨基酸残基是相同的。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述重复单元包括AA、TT、SS、EE、GG、PP、AAA、TTT、SSS、EEE和GGG中的一种或多种；优选地，所述重复单元包括AA、TT、SS、EE、PP、AAA、TTT、SSS和EEE中的一种或多种；更优选地，所述多肽包括以下氨基酸序列：PAAEESSTTEEAX1ASSPEEE(SEQ ID NO:27)，其中X1代表A或E；或，GAAEESS(SEQ ID NO:28)、EEAAASSGEEE(SEQ ID NO:73)、AAGGSSSE(SEQ ID NO:74)。6.如权利要求1
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5中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括如SEQ IDNO:1～26所示的氨基酸序列；优选地，所述多肽的氨基酸序列为(1)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:23；或，(2)SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。7.一种提高蛋白可溶性表达的方法，其特征在于，将目的蛋白与如权利要求1～6任一项所述的多肽融合表达，形成融合蛋白。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，一个或多个拷贝的所述多肽融合表达于多个相同或不同的目的蛋白之间，和/或表达于所述融合蛋白的C端或N端；优选地，一个或多个拷贝的所述多肽融合表达于多个不同的目的蛋白之间，和/或表达于所述融合蛋白的C端或N端。9.一种融合蛋白，其特征在于，其包括如权利要求1～6任一项所述的多肽及目的蛋白；所述目的蛋白为一个或多个需要可溶性表达的生物活性蛋白；优选地，所述生物活性蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐敏，王春梅，王建辉，
申请(专利权)人：派格生物医药苏州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：