尿酸酶或其同功异型物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及酶的纯化领域，特别涉及尿酸酶或其同功异型物及其制备方法。本发明专利技术采用疏水层析及阴离子交换层析纯化对尿酸酶或其同功异型物进行纯化，得到的尿酸酶或其同功异型物的纯度和比活均显著提高，同时拥有很高的蛋白回收率，适合工业化生产。适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
尿酸酶或其同功异型物及其制备方法


[0001]本专利技术涉及酶的纯化领域，特别涉及尿酸酶或其同功异型物及其制备方法。

技术介绍

[0002]尿酸酶(EC 1.7.3.3)也称尿酸氧化酶，是生物体内嘌呤代谢的关键酶，可以将尿酸水解为易溶于水的尿囊素排出体外。尿酸酶广泛存在于自然界中，包括很多哺乳动物(猪、牛、犬、鼠等)、豆类植物以及微生物等等。
[0003]灵长类动物包括人类在进化过程中由于基因突变，导致尿酸酶不表达，因此人体内缺失尿酸氧化酶，尿酸成为人体内嘌呤代谢的最终产物，人体内血浆尿酸水平大约是非灵长类动物的10倍。尿酸是一种弱酸，在生理条件下，大多数尿酸以单钠尿酸盐的形式存在，而单钠尿酸盐的溶解度很低，因此当尿酸盐浓度较高时，便可引起高尿酸血症；高血清尿酸浓度是导致痛风、肾结石和血管类疾病的直接原因。长时间的高尿酸状态，尿酸盐在机体组织中沉积下来造成损害出现痛风；血尿酸水平越高，未来5年发生痛风的可能性就越大。
[0004]从上世纪60年代McCarty和Hollander阐明了单钠尿酸盐的结晶是痛风致病机理后，人们对用尿酸酶来治疗痛风的探索就没有停止：1968年Laboureur P从黄曲霉(Aspergillus flavus)中提取天然尿酸氧化酶治疗肿瘤裂解综合征；2002年FDA批准重组黄曲霉的尿酸氧化酶Rasburicase用于治疗肿瘤裂解综合征引起的高尿酸血症，但由于其强免疫原性及半衰期较短，尝试痛风治疗的探索受阻；2010年FDA批准Pegloticase作为治疗顽固性痛风的治疗药物，为了解决尿酸氧化酶Rasburicase在治疗时出现的的高免疫原性和半衰期较短的问题，该药品使用哺乳动物来源的尿酸氧化酶并将其进行PEG化，Pegloticase中尿酸酶被共价结合至聚乙二醇单甲醚[mPEG](分子量10kDa)。但Pegloticase仍然因为免疫原性问题影响了其临床应用，在III期临床试验中发现，92％的患者中产生抗
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pegloticase抗体，42％的患者检出抗
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PEG抗体，高抗
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pegloticase抗体不仅影响了降尿酸疗效，还引起患者过敏反应(6.5％)；此外，Pegloticase通过静脉输注给药，26％患者发生输液反应，包括面部潮红，荨麻疹，低血压等。
[0005]对于尿酸酶制剂，其免疫原性源于几个因素：1.尿酸酶本身的性质，如尿酸酶容易发生凝集，凝集的尿酸酶免疫原性更强；如尿酸酶的生物活性低，低活性意味着达到治疗效果使用的剂量高，注射的次数多，因此刺激机体产生抗体滴度也高；如尿酸酶的外源性，人体没有尿酸酶，所有尿酸酶都是外源性的，都会刺激人体抗体产生；如尿酸酶的种属特异性表位，T细胞抗原决定簇的强弱和数目也是决定尿酸酶免疫原性的重要因素之一。2.尿酸酶制剂的组成以及给药途径，给药剂量和给药次数。3.患者个体因素。
[0006]综合以上因素，新一代的尿酸酶制剂需要具有活性高用量少，用药次数少，溶解度好不易凝集，抗原决定簇少等特征，才能达到更安全有效的治疗。另外一个有力手段是，增强尿酸酶定向或靶向痛风石部位发挥局部作用，如在痛风石局部释放尿酸酶，可以加快尿酸石的溶解。疗效的增强可以缩短用药周期，减少用药剂量和输注次数，因此可以防止和降
低免疫反应。而截止目前，国内还未有尿酸酶类产品上市。
[0007]现有技术中，为了获得各生物来源的尿酸酶及其变构体，一般会利用工程菌进行表达、发酵，再对发酵液进行纯化，纯化时，大多需要采用盐析、超滤、透析、亲和层析、离子交换、疏水层析、凝胶过滤等多种复合手段，操作复杂，蛋白回收率低，不适合工业化生产，部分较为剧烈的纯化条件甚至会影响到尿酸酶的生物活性。鉴于上述情况，本领域亟需一种高效便捷并且能最大程度保持酶活性的尿酸酶纯化方法。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了尿酸酶及其制备方法。本专利技术通过优化纯化方法，提高尿酸酶纯化产物的纯度、回收率以及比活。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供了尿酸酶或其同功异型物的纯化方法，包括将含有尿酸酶或其同功异型物的待纯化样品，分别经疏水层析和阴离子交换层析纯化的步骤。
[0011]所述疏水层析和阴离子交换层析并无严格的先后顺序，例如，在一个实施方案中，待纯化样品先进行疏水层析，再进行阴离子交换层析；而在另一个实施方案中，待纯化样品先进行阴离子交换层析，再进行疏水层析。本领域技术人员应当可以理解，上述两次层析之间，还可以任选地包括收集、浓缩、复溶、稀释等操作。
[0012]在本专利技术的一些实施方案中，经疏水层析和阴离子交换层析纯化的样品，无需进一步的纯化即可产生令人满意的纯度和/或酶活，所述进一步的纯化包括但不限于盐析、超滤、透析、离子交换、疏水层析、凝胶层析(又称分子筛或排阻层析)或其组合。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，经纯化后的尿酸酶或其同功异型物的纯度可达到85％以上，优选90％、91％、92％、93％或94％以上，更优选95％、96％、97％或98％以上，甚至更优选99％以上。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，在纯化之前还包括样品处理的步骤，所述样品处理的步骤包括将样品处理溶液与待纯化样品混合，并收集用于纯化步骤的尿酸酶或其同功异型物粗品；所述样品处理溶液包括盐。依据本领域的通常理解，凡是由金属阳离子(或铵根离子)与阴离子组成的盐均可用于所述样品处理溶液，在一些具体的实施方案中，所述盐的阴离子可选自PO
43
‑
、HPO
42
‑
、H2PO4‑
、SO
42
‑
、CH3COO
‑
、F
‑
、Cl
‑
、Br
‑
、NO3‑
、ClO4‑
、I
‑
和SCN
‑
中的一种或多种；所述所述盐的阳离子可选自NH
4+
、Rb
+
、K
+
、Na
+
、Cs
+
、Li
+
、Mg
2+
、Ca
2+
和Ba
2+
中的一种或多种。
[0015]具体而言，实例性的盐可以选自Na3PO4、K3PO4、Na2HPO4、K2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、K2SO4、CH3COONa、CH3COOK、NaF、KF、CsF、NH4Cl、NaCl、KCl、NaBr、KBr、NaI和KI中的一种或多种；优选自(NH4)2SO4、Na2SO4、K2SO4、NH4Cl、NaCl和KCl中的一种或多种；更优选自(NH4)2SO4、NaCl和KCl中的一种或多种；甚至更优选为(NH4)2SO4。
[0016]收集尿酸酶或其同功异型物的粗品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.尿酸酶或其同功异型物的纯化方法，其特征在于，包括将含有尿酸酶或其同功异型物的待纯化样品，分别经疏水层析和阴离子交换层析纯化的步骤。2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在纯化之前还包括样品处理的步骤，所述样品处理的步骤包括将样品处理溶液与待纯化样品混合，并收集用于纯化步骤的尿酸酶或其同功异型物粗品；所述样品处理溶液包括盐；所述盐的阴离子选自PO
43
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、HPO
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、H2PO4‑
、SO
42
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、CH3COO
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、F
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、Cl
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、Br
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、NO3‑
、ClO4‑
、I
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和SCN
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中的一种或多种；所述盐的阳离子包括NH
4+
、Rb
+
、K
+
、Na
+
、Cs
+
、Li
+
、Mg
2+
、Ca
2+
和Ba
2+
中的一种或多种；。3.如权利要求2所述的纯化方法，其中，所述盐选自(NH4)2SO4、Na2SO4、K2SO4、NH4Cl、NaCl和KCl中的一种或多种；优选自(NH4)2SO4、NaCl和KCl中的一种或多种；更优选为(NH4)2SO4。4.如权利要求2或3所述的纯化方法，其中，样品处理溶液与待纯化样品混合后，混合物中的盐浓度为0.05
‑
3M；优选为0.2
‑
2M；更优选为0.5
‑
1.5M；甚至更优选为0.75
‑
1.25M。5.如权利要求1
‑
4任一所述的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析包括第一平衡、上样、第二平衡、洗脱杂质和蛋白溶出的步骤；所述第一平衡、第二平衡、洗脱杂质和蛋白溶出步骤所用的流动相中包含盐，其中，第二平衡、洗脱杂质和蛋白溶出步骤所用流动相中的盐浓度依次降低。6.如权利要求5所述的纯化方法，其中，疏水层析中所述盐选自(NH4)2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐敏，王建辉，王圣，王春梅，
申请(专利权)人：派格生物医药苏州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：