一种检测14种高危型HPV的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种同步检测14种高危型HPV的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括针对14种高危型HPV的两个体系的核酸提取液、检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于以上这些高危型HPV检测的引物和探针，并合理分配检测体系，以及在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以同步实现对14种高危型HPV的实时、快速检测，并且灵敏度高、特异性好，扩增产物RNA易降解不会引起环境污染，且在检测过程中不会引起样本交叉污染。且在检测过程中不会引起样本交叉污染。

【技术实现步骤摘要】
35的靶标序列特异性结合的第八引物、用于与HPV 51的靶标序列特异性结合的第九引物、用于与HPV 52的靶标序列特异性结合的第十引物、用于与HPV 58的靶标序列特异性结合的第十一引物、用于与HPV 56和HPV 66的靶标序列特异性结合的第十二引物、和一条通用引物；
[0006](T2)核酸提取液2：其包含含有用于捕获5种高危型HPV的检测序列的第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针的固相支持物，以及分别用于与5种高危型HPV的靶标序列特异性结合的4条引物，其中所述5种高危型HPV包括HPV 18、39、45、59、68，所述4条引物包括用于与HPV 18的靶标序列特异性结合的第十七引物、用于与HPV 45的靶标序列特异性结合的第十八引物、用于与HPV 59的靶标序列特异性结合的第十九引物、用于与HPV 39和HPV 68的靶标序列特异性结合的第二十引物、和一条所述通用引物；
[0007](T3)扩增检测液1.1：其包含第一引物、第二引物、第三引物和第四引物，其中所述第一引物与所述第十一引物和通用引物配合，用于扩增HPV 58的靶标序列，所述第二引物与所述第七引物、第十引物和通用引物配合，用于扩增HPV 33和HPV 52的靶标序列，所述第三引物与所述第十二引物和通用引物配合，用于扩增HPV 56和HPV 66的靶标序列，所述第四引物与所述第五引物、第六引物、第八引物、第九引物和通用引物配合，分别用于扩增HPV 16、31、35、51的靶标序列；
[0008](T4)扩增检测液1.2：其包含所述通用引物、第一靶标检测探针、第二靶标检测探针、第三靶标检测探针和第四靶标检测探针，其中所述第一靶标检测探针与HPV 51的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第二靶标检测探针与HPV 16、31、35的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第三靶标检测探针与HPV 33、52、58的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第四靶标检测探针与HPV 56、66的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
[0009](T5)扩增检测液2.1：其包含第十三引物、第十四引物、第十五引物和第十六引物，其中所述第十三引物与所述第十七引物和通用引物配合，用于扩增HPV 18的靶标序列，所述第十四引物与所述第十八引物和通用引物配合，用于扩增HPV 45的靶标序列，所述第十五引物与所述第十九引物和通用引物配合，用于扩增HPV 59的靶标序列，所述第十六引物与所述第二十引物和通用引物配合，用于扩增HPV 39和HPV 68的靶标序列；
[0010](T6)扩增检测液2.2：其包含所述通用引物、第五靶标检测探针、第六靶标检测探针、第七靶标检测探针和第八靶标检测探针，其中所述第五靶标检测探针与HPV 18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第六靶标检测探针与HPV 45的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第七靶标检测探针与HPV 59的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第八靶标检测探针与HPV 39和HPV 68的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
[0011](T7)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；
[0012]其中：
[0013]所述第一特异性捕获探针至第四特异性捕获探针分别包含如SEQ ID NO:42
‑
SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
[0014]所述第一引物至第二十引物分别包含如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；
[0015]所述通用引物包含如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；且所述第五引物至第十二引物，以及所述第十七引物至第二十引物的5
’
端序列均为所述通用引物的序列；
[0016]所述第一靶标检测探针至第八靶标检测探针分别包含如SEQ ID NO:22
‑
SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。
[0017]在一些实施方式中，在所述第一靶标检测探针至第八靶标检测探针的核苷酸序列两端均分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且八者携带的荧光报告基团相同或不同。
[0018]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0019](M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS；优选含有5
‑
50mM HEPES、50
‑
500mM NaCl、0.5
‑
1.5％ SDS、1
‑
10mM EDTA；和/或
[0020](M2)矿物油；和/或
[0021](M3)阳性对照：含有HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68的E6/E7体外转录RNA的体系；和/或
[0022](M4)阴性对照：不含有人乳头瘤病毒靶标核酸的体系。
[0023]在一些实施方式中，所述核酸提取液1的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％ LLS(十二烷基磺酸锂)、1
‑
50μΜ所述的第一特异性捕获探针和第二特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠、25
‑
150pmol/mL所述的第五引物至第十二引物、25
‑
150pmol/mL所述的通用引物。
[0024]在一些实施方式中，所述核酸提取液2的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％ LLS(十二烷基磺酸锂)、1
‑
50μΜ所述的第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠、25
‑
150pmol/mL所述的第十七引物至第二十引物、25
‑
150pmol/mL所述的通用引物。
[0025]在一些实施方式中，所述扩增检测液1.1的组分包括：10
‑
50mM Tris、5
‑
40mM KCl、10
‑
40mM MgCl2、1
‑
20mM NTP、0.1
‑
10mM dNTPs、1
‑
10％ PVP40、250
‑
750pmol/mL所述的第一引物至第四引物。
[0026]在一些实施方式中，所述扩增检测液1.2的组分包括：10
‑
50mM Tris、5
‑
40mM KCl、10
‑
40mM MgCl2、1
‑
20mM NTP、0.1
‑
10mM dNTPs、1
‑
10％ PVP40、143
‑
857pmol/mL所述的通用引物、143
‑
857pmol/mL所述的第一靶标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测14种高危型HPV的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：(T1)核酸提取液1：其包含含有用于捕获9种高危型HPV的检测序列的第一特异性捕获探针和第二特异性捕获探针的固相支持物，以及分别用于与9种高危型HPV的靶标序列特异性结合的9条引物，其中所述9种高危型HPV包括HPV 16、31、33、35、51、52、56、58、66，所述9条引物包括用于与HPV 16的靶标序列特异性结合的第五引物、用于与HPV 31的靶标序列特异性结合的第六引物、用于与HPV 33的靶标序列特异性结合的第七引物、用于与HPV 35的靶标序列特异性结合的第八引物、用于与HPV 51的靶标序列特异性结合的第九引物、用于与HPV 52的靶标序列特异性结合的第十引物、用于与HPV 58的靶标序列特异性结合的第十一引物、用于与HPV 56和HPV 66的靶标序列特异性结合的第十二引物、和一条通用引物；(T2)核酸提取液2：其包含含有用于捕获5种高危型HPV的检测序列的第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针的固相支持物，以及分别用于与5种高危型HPV的靶标序列特异性结合的4条引物，其中所述5种高危型HPV包括HPV 18、39、45、59、68，所述4条引物包括用于与HPV 18的靶标序列特异性结合的第十七引物、用于与HPV 45的靶标序列特异性结合的第十八引物、用于与HPV 59的靶标序列特异性结合的第十九引物、用于与HPV 39和HPV 68的靶标序列特异性结合的第二十引物、和一条所述通用引物；(T3)扩增检测液1.1：其包含第一引物、第二引物、第三引物和第四引物，其中所述第一引物与所述第十一引物和通用引物配合，用于扩增HPV 58的靶标序列，所述第二引物与所述第七引物、第十引物和通用引物配合，用于扩增HPV 33和HPV 52的靶标序列，所述第三引物与所述第十二引物和通用引物配合，用于扩增HPV 56和HPV 66的靶标序列，所述第四引物与所述第五引物、第六引物、第八引物、第九引物和通用引物配合，分别用于扩增HPV 16、31、35、51的靶标序列；(T4)扩增检测液1.2：其包含所述通用引物、第一靶标检测探针、第二靶标检测探针、第三靶标检测探针和第四靶标检测探针，其中所述第一靶标检测探针与HPV 51的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第二靶标检测探针与HPV 16、31、35的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第三靶标检测探针与HPV 33、52、58的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第四靶标检测探针与HPV 56、66的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；(T5)扩增检测液2.1：其包含第十三引物、第十四引物、第十五引物和第十六引物，其中所述第十三引物与所述第十七引物和通用引物配合，用于扩增HPV 18的靶标序列，所述第十四引物与所述第十八引物和通用引物配合，用于扩增HPV 45的靶标序列，所述第十五引物与所述第十九引物和通用引物配合，用于扩增HPV 59的靶标序列，所述第十六引物与所述第二十引物和通用引物配合，用于扩增HPV 39和HPV 68的靶标序列；(T6)扩增检测液2.2：其包含所述通用引物、第五靶标检测探针、第六靶标检测探针、第七靶标检测探针和第八靶标检测探针，其中所述第五靶标检测探针与HPV 18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第六靶标检测探针与HPV 45的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第七靶标检测探针与HPV 59的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第八靶标检测探针与HPV 39和HPV 68的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；(T7)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
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MLV反转录酶；
其中：所述第一特异性捕获探针至第四特异性捕获探针分别包含如SEQ ID NO:42
‑
SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；所述第一引物至第二十引物分别包含如SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；所述通用引物包含如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；且所述第五引物至第十二引物，以及所述第十七引物至第二十引物的5
’
端序列均为所述通用引物的序列；所述第一靶标检测探针至第八靶标检测探针分别包含如SEQ ID NO:22
‑
SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，在所述第一靶标检测探针至第八靶标检测探针的核苷酸序列两端均分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且八者携带的荧光报告基团相同或不同。3.根据权利要求1或2所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS；优选含有5
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50mM HEPES、50
‑
500mM NaCl、0.5
‑
1.5％SDS、1
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10mM EDTA；和/或(M2)矿物油；和/或(M3)阳性对照：含有HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68的E6/E7体外转录RNA的体系；和/或(M4)阴性对照：不含有人乳头瘤病毒靶标核酸的体系。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液1的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％LLS(十二烷基磺酸锂)、1
‑
50μΜ所述的第一特异性捕获探针和第二特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠、25
‑
150pmol/mL所述的第五引物至第十二引物、25
‑
150pmol/mL所述的通用引物；所述核酸提取液2的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％LLS(十二烷基磺酸锂)、1
‑
50μΜ所述的第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠、25
‑
150pmol/mL所述的第十七引物至第二十引物、25
‑
150pmol/mL所述的通用引物；所述扩增检测液1.1的组分包括：10
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50mM Tris、5
‑
40mM KCl、...

【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，张帝，沈晓宁，钱卫国，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：