一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，进一步地还提供一种同时检测六种念珠菌和阴道毛滴虫的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括针对六种念珠菌、或进一步针对阴道毛滴虫的核酸提取液、检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于以上这些微生物检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对六种念珠菌、或六种念珠菌联合阴道毛滴虫的实时、快速检测，并且灵敏度高、特异性好，扩增产物RNA易降解不会引起环境污染，且在检测过程中不会引起样本交叉污染。不会引起样本交叉污染。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，还涉及一种同时检测六种念珠菌和阴道毛滴虫的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别是涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的念珠菌和阴道毛滴虫的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

技术介绍

[0002]阴道炎(Vaginitis)即阴道炎症，是导致外阴阴道症状如瘙痒、灼痛、刺激和异常流液的一组病症。临床上常见有：细菌性阴道病(占有症状女性22％～50％)、念珠菌性阴道炎(17％～39％)、滴虫性阴道炎(4％～35％)、老年性阴道炎、幼女性阴道炎。
[0003]念珠菌性阴道炎是由念珠菌(又称假丝酵母，VVC)属真菌感染所致，在念珠菌属中，白色念珠菌(Candida albicans)是最常见的致病菌，约占85％～95％。而在非白色念珠菌引起的感染中，光滑念珠菌(Candida glabrata)和热带念珠菌(Candida tropicalis)是最常见的，另外还有如克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)和都柏林念珠菌(canada dubliniemis)等，主要发生于免疫受损的女性中。尤其是近年来，随着抗生素等的广泛应用，念珠菌性阴道炎对病原菌菌谱发生改变，非白色念珠菌引起的念珠菌性阴道炎的病例逐渐增多，且对传统的治疗法具有耐药性，其中属光滑念珠菌和克柔念珠菌耐药性占比最多。因此对念珠菌，尤其是对念球菌中的光滑念珠菌、克柔念珠菌等进行针对性检测具有重要的流行病学和临床治疗意义。
[0004]滴虫性阴道炎是由阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，TV)感染所致，毛滴虫是一种寄生虫，但是肉眼看不见，这种毛滴虫呈广梨形或椭圆形，长为10～30μm，宽10～20μm，头部有4根与虫体等长的鞭毛，在显微镜下可以清楚地看到这种毛滴虫。TV遍及世界各地，据估计，全世界每年妇女感染人数为1.8亿。因此，对阴道毛滴虫进行针对性检测也具有重要的流行病学和临床治疗意义。
[0005]目前，对致病性念珠菌和阴道毛滴虫进行检测的方法主要为分子生物学方法，主要包括DNA探针杂交技术和PCR技术。例如专利文献CN101638688A(以下称文献1)公开一种鉴定致病性念珠菌(包括白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌)的专用探针，其利用一对针对念珠菌的通用引物进行PCR扩增，并利用分别针对每一种念珠菌的DNA探针进行杂交，根据杂交结果判定每种念珠菌的存在与否。又如专利文献CN110551840A(以下称文献2)公开一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其包括A管、B管和C管，其中A管含有针对四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌)的一对通用引物和分别针对这四种念珠菌的荧光标记探针，能够同时对以上四种念珠菌进行检测。再如专利文献CN109971883A(以下称文献3)公开一种念珠菌分种检测的
IDNO:9所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；
[0014]所述第三引物包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；
[0015]所述第五引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第六引物包含如SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列，所述第三靶标检测探针包含如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。
[0016]本专利技术另一方面提供一种同时检测六种念珠菌和阴道毛滴虫的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，命名为第二试剂盒，其在上述的第一试剂盒的基础上还包括：
[0017](a)第四特异性捕获探针：其存在于所述核酸提取液中，用于捕获阴道毛滴虫的检测序列，且所述第四特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；
[0018](b)第七引物、第八引物和第四靶标检测探针：三者存在于所述检测液中，配合用于检测阴道毛滴虫的靶标序列，其中所述第七引物包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述第八引物包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述第四靶标检测探针包含如SEQ IDNO:27所示的核苷酸序列，且在所述第四靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且携带的荧光报告基团与第一、第二、第三靶标检测探针携带的荧光报告基团不同。
[0019]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0020](M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS；优选为5
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50mM HEPES、50
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500mM NaCl、0.5
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1.5％SDS、1
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10mM EDTA；和/或
[0021](M2)矿物油；和/或
[0022](M3)阳性对照：含有Cspp、光滑念珠菌、克柔念珠菌核酸，或进一步含有阴道毛滴虫核酸的体系；和/或
[0023](M4)阴性对照：不含有Cspp、光滑念珠菌、克柔念珠菌核酸，或进一步不含有阴道毛滴虫核酸的体系。
[0024]在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250
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800mM HEPES、4
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10％ LLS(十二烷基磺酸锂)、1
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50μM的第一特异性捕获探针、1
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50μM的第二特异性捕获探针、1
‑
50μM的第三特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠；可选地，所述核酸提取液的组分还包括1
‑
50μM的第四特异性捕获探针。
[0025]在一些实施方式中，所述检测液的组分包括：10
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50mM Tris、5
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40mM KCl、10
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40mM MgCl2、1
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20mM NTP、0.1
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10mM dNTPs、1
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10％PVP40、250
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750pmol/mL的第一引物、250
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750pmol/mL的第二引物、250
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750pmol/mL的第三引物、250
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750pmol/mL的第四引物、250
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750pmol/mL的第五引物、250
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750pmol/mL的第六引物、250
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750pmol/mL的第一靶标检测探针、250<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，命名为第一试剂盒，其特征在于，包括：(T1)核酸提取液：其包含含有第一特异性捕获探针、第二特异性捕获探针和第三特异性捕获探针的固相支持物，其中所述第一特异性捕获探针用于捕获白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和/或都柏林念珠菌(这四种念珠菌合称为Cspp)的检测序列，所述第二特异性捕获探针用于捕获光滑念珠菌的检测序列，所述第三特异性捕获探针用于捕获克柔念珠菌的检测序列；(T2)检测液：其包含第一引物、第二引物、第一靶标检测探针、第三引物、第四引物、第二靶标检测探针、第五引物、第六引物、第三靶标检测探针；其中所述第一引物、第二引物和所述第一靶标检测探针配合，用于检测Cspp的靶标序列；所述第三引物、第四引物和所述第二靶标检测探针配合，用于检测光滑念珠菌的靶标序列；所述第五引物、第六引物和所述第三靶标检测探针配合，用于检测克柔念珠菌的靶标序列；在所述第一靶标检测探针、第二的靶标检测探针、和第三靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且三者携带的荧光报告基团不同；(T3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
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MLV反转录酶；其中：所述第一特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，所述第二特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，所述第三特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；所述第五引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第六引物包含如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述第三靶标检测探针包含如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。2.一种同时检测六种念珠菌和阴道毛滴虫的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，命名为第二试剂盒，其特征在于，所述第二试剂盒在权利要求1所述的第一试剂盒的基础上还包括：(a)第四特异性捕获探针：其存在于所述核酸提取液中，用于捕获阴道毛滴虫的检测序列，且所述第四特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；(b)第七引物、第八引物和第四靶标检测探针：三者存在于所述检测液中，配合用于检测阴道毛滴虫的靶标序列，其中所述第七引物包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述第八引物包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述第四靶标检测探针包含如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，且在所述第四靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且携带的荧光报告基团与第一、第二、第三靶标检测探针携带的荧光报告基团不同。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS；优选为5
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50mM HEPES、50
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500mM NaCl、0.5
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1.5％SDS、1
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10mM EDTA；和/或
(M2)矿物油；和/或(M3)阳性对照：含有Cspp、光滑念珠菌、克柔念珠菌核酸，或进一步含有阴道毛滴虫核酸的体系；和/或(M4)阴性对照：不含有Cspp、光滑念珠菌、克柔念珠菌核酸，或进一步不含有阴道毛滴虫核酸的体系。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液的组分包括：250
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800mM HEPES、4
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10％LLS(十二烷基磺酸锂)、1
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50μΜ的第一特异性捕获探针、1
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50μΜ的第二特异性捕获探针、1
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50μΜ的第三特异性捕获探针、50
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500mg/L磁珠；可选地，所述核酸提取液的组分还包括1
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50μΜ的第四特异性捕获探针；所述检测液的组分包括：10
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50mM Tris、5
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40mM KCl、10
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40mM MgCl2、1
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20mM NTP、0.1
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10mM dNTPs、1
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10％PVP40、250
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750pmol/mL的第一引物、250
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750pmol/mL的第二引物、250
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750pmol/mL的第三引物、250
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750pmol/mL的第四引物、250
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750pmol/mL的第五引物、250
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750pmol/mL的第六引物、250
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750pmol/mL的第一靶标检测探针、250
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750pmol/mL的第二靶标检测探针、250
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750pmol/mL的第三靶标检测探针；可选地，所述检测液的组分还包括250
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750pmol/mL的第七引物、250
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【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，钱卫国，沈晓宁，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：