一组鸭茅cpSSR标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组鸭茅cpSSR标记引物及其应用。该标记引物包括4对多态性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2、SEQ ID NO.3和4、SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8所示。本发明专利技术提供的标记引物填补了鸭茅cpSSR标记信息的空白，能够应用在鸭茅亚种群体结构和物种鉴定上，为鸭茅亚种的区分鉴定提供便利，为鸭茅的遗传多样性评价、种质鉴定及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。等研究奠定了基础。等研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一组鸭茅cpSSR标记引物及其应用


[0001]本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一组鸭茅cpSSR标记引物及其应用。

技术介绍

[0002]鸭茅(Dactylis glomerata L.)又名果园草(Orchardgrass)，属禾本科早熟禾亚科鸭茅属，具有叶多高产、耐阴性强、适口性好、营养价值高等优点，表现出良好的饲用价值和生态价值。作为一种高度变异的牧草，该属包含许多亚种，依据倍性水平可以把鸭茅属主要分为三大类：二倍体(2n＝2x＝14)，四倍体(2n＝2x＝28)和六倍体(2n＝2x＝42)。由于鸭茅亚种种类繁多，缺乏分类学上的诊断特征且亚种间高度的形态相似性，使得该属的分类变得困难。虽然以往的研究试图在细胞学和遗传学水平上对鸭茅属进行分类，但仍然缺乏对其亚种分类的统一标准，该属的分类识别与鉴定一直是植物分类学家面临的重大挑战与难题。因此，精准、快速、高效地识别鸭茅亚种，不仅是植物分类学家的迫切需要，而且对更好地开发和利用鸭茅资源，为进一步研究该属的分类具有重要意义。
[0003]叶绿体微卫星技术是近年来发展起来的一种新型高效的分子标记技术，既具有叶绿体基因组分子量小、多拷贝、结构简单、母性遗传等特点，又具有微卫星共显性、高多态性、操作简单、分布广泛等优点。由于具有SSR(微卫星序列)标记的优点又兼顾到叶绿体基因组的特点，所以cpSSR(叶绿体微卫星序列)可用于鉴定种以及亲缘关系很近的种，描述区域及个体水平的遗传差异。然而，目前有关鸭茅分子鉴定技术的研究，一般采用鸭茅的核基因组信息，但是采用叶绿体SSR标记鉴定鸭茅亚种的方法还未见报道，严重限制了鸭茅属分子鉴定技术的进一步发展。因此，基于鸭茅的叶绿体基因组数据，鉴定并开发SSR标记，筛选能够用于鸭茅属分子鉴定用的叶绿体SSR标记，对于推动鸭茅亚种的分类鉴定十分必要；基于cpSSR分子标记构建鸭茅指纹图谱，为品种保护提供参考。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一组用于区分鸭茅亚种的鸭茅cpSSR标记引物，可以填补鸭茅cpSSR标记信息的空白，还能用于鉴定鸭茅亚种群体结构和物种。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一组鸭茅cpSSR标记引物，包含4对多态性标记引物，其引物的核苷酸序列如下所示：
[0006]cpSSR1正向引物如SEQ ID NO.1所示；
[0007]cpSSR1反向引物如SEQ ID NO.2所示；
[0008]cpSSR2正向引物如SEQ ID NO.3所示；
[0009]cpSSR2反向引物如SEQ ID NO.4所示；
[0010]cpSSR3正向引物如SEQ ID NO.5所示；
[0011]cpSSR3反向引物如SEQ ID NO.6所示；
[0012]cpSSR4正向引物如SEQ ID NO.7所示；
[0013]cpSSR4反向引物如SEQ ID NO.8所示。
[0014]本专利技术还提供了一种含有上述鸭茅cpSSR标记引物的试剂盒。
[0015]本专利技术还提供了一种上述鸭茅cpSSR标记引物的制备方法，包含如下步骤：
[0016]1)提取鸭茅的叶绿体DNA；
[0017]2)对步骤1)中得到的叶绿体DNA进行高通量Illumina测序；
[0018]3)使用fastp软件对步骤2)中测序所得的原始数据进行过滤；
[0019]4)采用SPAdes 2软件对步骤3)中过滤所得的数据进行叶绿体基因组的组装；
[0020]5)利用MISA perl脚本软件搜索步骤4)中所得鸭茅亚种叶绿体基因组中分布的SSR位点；
[0021]6)利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，筛选后即得到4对鸭茅cpSSR标记引物。
[0022]其中，步骤5)中MISA perl脚本软件的参数设定为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3。
[0023]步骤6)中cpSSR引物设计的设计原则为：引物长度范围20个碱基；退火温度范围50～60℃；产物长度200～300bp。
[0024]本专利技术提供的鸭茅cpSSR标记引物可被应用于鸭茅亚种群体结构和物种鉴定中。
[0025]本专利技术还提供了一种基于上述的鸭茅cpSSR标记引物进行鸭茅亚种群体结构和物种鉴定的方法，包含如下步骤：
[0026]1)取待测的鸭茅亚种幼嫩叶片提取基因组DNA；
[0027]2)以步骤1)中所得的基因组DNA为模板，采用上述的4对cpSSR标记引物进行PCR扩增；
[0028]3)将步骤2)中扩增所得的产物通过电泳进行多态性检测，对清晰的条带进行统计；
[0029]4)根据步骤3)所得的统计数据构建种质群体结构图，即获得鸭茅亚种群体结构和物种鉴定的结果。
[0030]优选地，上述鸭茅亚种群体结构和物种鉴定方法的步骤2)中的PCR扩增，其PCR扩增体系为10μL：包含1μL的模板DNA，0.5μL的5pmolμL
‑1的上下游引物，5μL的2
×
Taq PCR MasterMix II，3μL的ddH2O；其PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸35s，共35个循环；72℃延伸5min，于4℃保存。
[0031]优选地，上述鸭茅亚种群体结构和物种鉴定方法的步骤3)中的电泳，其电泳缓冲液为1
×
TBE，电泳仪参数为200V稳压20min，280V稳压4h。
[0032]本专利技术提供了一种基于上述鸭茅cpSSR标记引物构建的指纹图谱，可被应用于鸭茅不同亚种的鉴定中。
[0033]本专利技术的鸭茅cpSSR标记引物，填补了鸭茅cpSSR标记信息的空白，具有以下优点：
[0034]本专利技术提供的4对鸭茅cpSSR标记引物能够在鸭茅亚种群体结构和物种鉴定上应用，利用开发的cpSSR标记引物分析了鸭茅亚种间的群体结构，为鸭茅亚种的区分鉴定提供便利，同时本专利技术提供的4对鸭茅cpSSR标记引物不但具有细胞核基因组SSR标记的共显性和高多态性等特点，还具有叶绿体基因组DNA的单亲遗传模式，不易发生重组，克服了传统分子标记开发效率低、周期长的特点，同时填补了鸭茅cpSSR开发的空白，为鸭茅的遗传多
样性评价、种质鉴定及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。
附图说明
[0035]图1为引物对cpSSR1对31份鸭茅亚种进行PCR扩增后的电泳检测图。
[0036]图2为引物对cpSSR2对31份鸭茅亚种进行PCR扩增后的电泳检测图。
[0037]图3为引物对cpSSR3对31份鸭茅亚种进行PCR扩增后的电泳检测图。
[0038]图4为引物对cpSSR4对31份鸭茅亚种进行PCR扩增后的电泳检测图。
[0039]图5为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组鸭茅cpSSR标记引物，其特征在于，包含4对多态性标记引物，其引物的核苷酸序列如下所示：cpSSR1正向引物如SEQ ID NO.1所示；cpSSR1反向引物如SEQ ID NO.2所示；cpSSR2正向引物如SEQ ID NO.3所示；cpSSR2反向引物如SEQ ID NO.4所示；cpSSR3正向引物如SEQ ID NO.5所示；cpSSR3反向引物如SEQ ID NO.6所示；cpSSR4正向引物如SEQ ID NO.7所示；cpSSR4反向引物如SEQ ID NO.8所示。2.一种含有如权利要求1所述鸭茅cpSSR标记引物的试剂盒。3.一种如权利要求1所述鸭茅cpSSR标记引物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：1)提取鸭茅的叶绿体DNA；2)对步骤1)中得到的叶绿体DNA进行高通量Illumina测序；3)使用fastp软件对步骤2)中测序所得的原始数据进行过滤；4)采用SPAdes 2软件对步骤3)中过滤所得的数据进行叶绿体基因组的组装；5)利用MISAperl脚本软件搜索步骤4)中所得鸭茅亚种叶绿体基因组中分布的SSR位点；6)利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，并筛选得到如权利要求1中所述的4对鸭茅cpSSR标记引物；其中，步骤5)中MISAperl脚本软件的参数设定为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯光燕，张新全，焦永娟，边昊阳，李顺凤，郝飞翔，黄琳凯，聂刚，余国辉，许肖恒，王苗利，杨忠富，李丹丹，汪霞，黄婷，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：