一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测技术领域，具体涉及一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法。本发明专利技术提供了一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示，将其合并一管作为多重引物组，可用于制备同时鉴定3类剧毒蘑菇的试剂盒。利用本发明专利技术所述多重引物组或试剂盒，可在同一反应管同时进行荧光PCR扩增，实现3大类12种剧毒蘑菇的同时检测鉴定，极大地提高了检测效率，降低了检测成本。本发明专利技术提供的多重实时荧光PCR试剂盒操作简便快捷，具有检测特异性强、灵敏度高等优点，适用于蘑菇及加工品等样品，可为食源性蘑菇中毒应急处置提供技术支撑。支撑。支撑。

【技术实现步骤摘要】
一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]在我国食品安全问题受到公众高度关注，其中食源性毒蘑菇中毒近年来频发，对人民生命健康造成了严重威胁。每年均有因误食野生毒蘑菇而引起中毒致死事件发生，因此对于野生蘑菇是否具有致命毒性的检测至关重要。目前已知的，引发我国食源性蘑菇中毒致死的主要物种为剧毒鹅膏菌类、肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇。
[0003]全世界范围内鹅膏菌种类有900～1000种，其中剧毒鹅膏菌约50种。据报道全球>90％的食源性蘑菇中毒致死事件均由此类毒蘑菇引起。目前，我国已发现并鉴定的剧毒鹅膏菌有12种，分别为致命鹅膏菌(Amanitin exitialis)、灰花纹鹅膏菌(A.fuliginea Hongo)、拟灰花纹鹅膏菌(A.fuligineoides)、软托鹅膏菌(A.molliuscula)、淡红鹅膏菌(A.pallidorosea)、小致命鹅膏菌(A.parviexitialis)、裂皮鹅膏菌(A.rimosa)、亚灰花纹鹅膏菌(A.subfuliginea)、黄盖鹅膏菌(A.subjunquillea)、假淡红鹅膏菌(A.subpallidorosea)、灰盖粉褶鹅膏菌(A.griseorosea)和鳞柄白鹅膏菌(A.virosa)等。此外，近年来肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇在我国导致了较多的蘑菇中毒致死事件，引发公众高度关注。中国疾病预防控制中心2019
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2021年发布的毒蘑菇中毒情况分析表明：这两种剧毒蘑菇已成为我国食源性蘑菇中毒致死的主要物种。仅2020
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2021年间，肉褐鳞环柄菇就导致30起蘑菇中毒事件，造成74人中毒，8人死亡；亚稀褶红菇导致26起中毒事件，造成76人中毒，10人死亡。
[0004]当今针对有毒蘑菇的检测鉴定方法主要包括形态鉴定法和分子鉴定法。形态鉴定法通过蘑菇的特征形态进行鉴别，需要有足够的经验和专业知识，对于普通人群难以准确鉴定，且蘑菇经过加工后难以通过形态进行辨别。以PCR为代表的分子生物学鉴定技术在剧毒蘑菇鉴定中已有应用报道。例如采用常规PCR方法进行单物种鉴定，采用环介导等温扩增技术(LAMP)分别进行剧毒鹅膏菌、肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇的检测鉴定。这类技术手段仅能进行单类剧毒蘑菇的鉴定，一旦发生蘑菇中毒疑似事件，需要采用不同的反应体系和反应程序，进行多次检测鉴定，增加了检测成本且降低了鉴定效率，不利于蘑菇中毒事件的应急处置。因此，亟需开发一种同时鉴定多类剧毒蘑菇的检测鉴定方法，以解决现有蘑菇中毒应急处置存在的技术难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法，操作简便，克服了常规单重分子检测技术的繁琐步骤，对食源性毒蘑菇中毒的应急处置及预防提供了技术支撑，检测通量及效率高、特异性好，具有良好的灵敏度。
[0006]本专利技术提供了一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组，所述剧毒蘑菇的种类包
括剧毒鹅膏菌、肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇；
[0007]针对剧毒鹅膏菌设计的引物组包括上游通用引物Universal A.spp
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F、下游通用引物Universal A.spp
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R和探针Universal A.spp
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P，所述上游通用引物Universal A.spp
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游通用引物Universal A.spp
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针UniversalA.spp
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0008]针对肉褐鳞环柄菇设计的引物组包括上游引物L.bru
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F、下游引物L.bru
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R和探针L.bru
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P，所述上游引物L.bru
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物L.bru
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针L.bru
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0009]针对亚稀褶红菇设计的引物组包括上游引物R.sub
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F、下游引物R.sub
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R和探针R.sub
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P，所述上游引物R.sub
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物R.sub
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针R.sub
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0010]优选的于，所述剧毒鹅膏菌包括致命鹅膏菌(Amanitin exitialis)、灰花纹鹅膏菌(A.fuliginea Hongo)、拟灰花纹鹅膏菌(A.fuligineoides)、淡红鹅膏菌(A.pallidorosea)、裂皮鹅膏菌(A.rimosa)、黄盖鹅膏菌(A.subjunquillea)、软托鹅膏菌(A.molliuscula)、亚灰花纹鹅膏菌(A.subfuliginea)、假淡红鹅膏菌(A.subpallidorosea)和鳞柄白鹅膏菌(A.virosa)。
[0011]优选的，在每条探针的5
’
端分别标记有不同的荧光基团，3
’
端标记有淬灭基团。
[0012]优选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX和CY5中的任一种，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
[0013]本专利技术还提供了一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的试剂盒，包括上述多重引物组的混合液。
[0014]优选的，所述混合液中，上游引物、下游引物和探针的浓度比为2：2：1，
[0015]且针对剧毒鹅膏菌、肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇设计的多重引物组的浓度比为1：1：1。
[0016]优选的，所述试剂盒中还包括反应液、阳性质控品、阴性质控品和无核酸酶水。
[0017]优选的，所述试剂盒中各引物的工作浓度为0.16～0.72μM，各探针的工作浓度为0.08～0.36μM。
[0018]本专利技术还提供了一种同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重实时荧光PCR方法，包括以下步骤：利用待测样品的DNA为模板，与上述多重引物组的混合液或上述试剂盒中的试剂配制反应体系，进行多重实时荧光PCR反应，如待测样品的扩增曲线呈S型曲线，且Ct≤35，判为阳性。
[0019]优选的，所述多重实时荧光PCR反应的反应程序，包括：94℃预变性180s；94℃变性5s，53℃退火15s，72℃延伸30s，40～50个循环。
[0020]有益效果：本专利技术提供了一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组，针对剧毒鹅膏菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组，其特征在于，所述剧毒蘑菇的种类包括剧毒鹅膏菌、肉褐鳞环柄菇和亚稀褶红菇；针对剧毒鹅膏菌设计的引物组包括上游通用引物UniversalA.spp
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F、下游通用引物UniversalA.spp
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R和探针UniversalA.spp
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P，所述上游通用引物Universal A.spp
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游通用引物UniversalA.spp
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针UniversalA.spp
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；针对肉褐鳞环柄菇设计的引物组包括上游引物L.bru
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F、下游引物L.bru
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R和探针L.bru
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P，所述上游引物L.bru
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物L.bru
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针L.bru
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；针对亚稀褶红菇设计的引物组包括上游引物R.sub
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F、下游引物R.sub
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R和探针R.sub
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P，所述上游引物R.sub
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物R.sub
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针R.sub
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。2.根据权利要求1所述多重引物组，其特征在于，所述剧毒鹅膏菌包括致命鹅膏菌(Amanitin exitialis)...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志勇，赵兰馨，周昌艳，赵晓燕，范婷婷，鄂恒超，张艳梅，李晓贝，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：