一种与葡萄抗寒性相关的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记及其应用,通过前期筛选得到抗寒性强的葡萄品种和抗寒性弱的葡萄品种之间具有显著表达差异的VvCML基因，在VvCML基因上挖掘得到了具有显著差异的SNP位点，突变位点为148bpC/T的突变。本发明专利技术通过鉴定VvCML基因序列与葡萄抗寒性的关系，开发了与抗寒性相关的SNP分子标记，并进一步进行四引物法直接PCR分型，实现对葡萄幼苗直接而快速的遗传鉴定，可对野生资源驯化育种及传统杂交育种早期评价，加快育种进展，推动品种优化，本发明专利技术通过设计特异性引物进行PCR，能有效实现SNP位点基因分型，具有操作简便、成本低等特点。成本低等特点。成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种与葡萄抗寒性相关的SNP分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于果树分子生物学
，具体涉及与葡萄抗寒性相关的SNP分子标记、以及检测葡萄抗寒性状的方法。

技术介绍

[0002]单核苷酸多态性(Si ngl e
‑
Nuc l eot ide Po lymorph i sm，SNP)是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异引起的DNA片段的多态性。SNP涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失。SNP目前有多种检测方法，常用的包括，PC直接检测、DNA芯片、高通量二代测序技术等。通过检测SNP位点检测基因型是近年兴起的一种方法。分子标记在园艺作物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种技术大大提高选育效率，节省育种时间、成本，为育种学家在分子水平上打开了探索道路。
[0003]葡萄作为全球重要的经济果树作物之一，被广泛用于酿酒、加工和鲜食。近十年来，中国葡萄种植，无论是栽培面积、产量，都取得了迅猛发展。我国葡萄的主栽区多位于寒冷、干旱、半干旱区域，这些地区大多冬季寒冷，气候干燥。而我国目前生产上主栽的欧亚种和欧美杂交种葡萄，对低温干旱气候适应性较差。葡萄冷害和冻害问题是我国尤其是北方地区葡萄生产面临的主要问题。目前田间所采取的主要措施是下架埋土防寒，但其繁重的工作量会消耗大量的人力财力。同时，埋土过程中易对树体、根系产生伤害，缩短树体生产年限；因此，培育优质抗寒葡萄品种，提高葡萄的抗寒性是我国葡萄产业有待解决的重要课题。
[0004]葡萄抗寒性是受多基因控制的数量性状，难以用常规育种方法来快速改良，无法清晰的区别性状差异，而通过分子生物技术鉴定葡萄抗寒性相关的主效基因或分子标记，可以有效提高育种效率，同时也为传统育种提供一定的依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种与葡萄抗寒性相关的SNP分子标记及其应用，本专利技术通过设计特异性引物进行PCR，能有效实现SNP位点基因分型，具有操作简便、成本低等特点。
[0006]本专利技术的目的是通过下述技术方案予以实现：一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记，该SNP分子标记位于葡萄第2号染色体第8876325bp处，位于VvCML基因，核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示，其序列中第148位碱基R为T/C，导致葡萄抗寒性出现多态性。
[0007]一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记在鉴定葡萄抗寒性SNP芯片中的应用，该芯片的核苷酸序列为SEQ I D NO.1，或者探针3'端的最末一个碱基，紧挨所述核苷酸序列SEQ I D NO.1中第148位碱基的SNP位点。
[0008]一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记制备鉴定葡萄抗寒性的试剂盒或检测装置中的应用，包括用于特异性检测核苷酸序列SEQ I D NO.1，其序列中第148位碱基R为T/C一种或多种引物，或引物和探针的组合。
[0009]进一步地，所述引物和/或探针选自：用于测序检测的特异性引物和测序引物，所述引物的序列分别如外引物F、内引物R、内引物F、外引物R，具体如下；
[0010]外引物F：5
’‑
ATGAGCGTGGATGAACCG
‑3’
[0011]内引物R：5
’‑
GTCCAGCTGCTCGGA
‑3’
[0012]内引物F：5
’‑
GGTCTGAAACCAAATC
‑3’
[0013]外引物R：5
’‑
CTAGGCCCATGAATTATCAA
‑3’
。
[0014]进一步地，SNP分子标记的试剂在制备鉴定葡萄抗寒性的试剂盒或检测装置中的应用，包含：
[0015]外引物F：5
’‑
ATGAGCGTGGATGAACCG
‑3’
[0016]内引物R：5
’‑
GTCCAGCTGCTCGGA
‑3’
[0017]内引物F：5
’‑
GGTCTGAAACCAAATC
‑3’
[0018]外引物R：5
’‑
CTAGGCCCATGAATTATCAA
‑3’
。
[0019]试剂盒的应用，所述试剂盒在如下1)
‑
3)至少一项中的应用，具体包括如下方面；
[0020]4)鉴定葡萄品种的抗寒性状；
[0021]5)筛选抗寒性强的葡萄品种、或淘汰抗寒性弱的葡萄品种；
[0022]6)通过遗传改良培育抗寒性强的葡萄品种。
[0023]一种鉴定葡萄抗寒性状的方法，包括以下步骤：
[0024]4)提取待检测葡萄叶片的基因组DNA；
[0025]5)以待检测葡萄的基因组DNA为模板，采用两种引物组合，利用外引物F和内引物R；内引物F和外引物R分别进行PCR扩增；
[0026]6)对扩增产物进行测序，根据测序比对结果，对葡萄抗寒性强弱进行判断：扩增产物第148位碱基为C的类型抗寒性强于扩增产物第148位碱基为T的类型。
[0027]一种鉴定葡萄抗寒性状的方法，包括以下步骤：
[0028]5)提取待检测葡萄叶片的基因组DNA；
[0029]6)以待检测葡萄的基因组DNA为模板，采用两种引物组合分别进行PCR扩增；所述两种引物组合为外引物F和内引物R、内引物F和外引物R；
[0030]7)将两者的PCR产物混匀，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物将SNP进行分型。
[0031]8)分析分型结果，权利1所述SNP分子标记，其特征在于，C/C纯合的葡萄材料，可扩增出162bp特异条带。T/T纯合的葡萄材料，可扩增出360bp特异条带。C/T杂合的葡萄材料，可扩增出162bp与360bp两种条带类型。T/T基因型为抗寒性强，C/C基因型为抗寒性弱，C/T基因型为中间型。
[0032]一种选育高抗寒性的葡萄品种的方法，包括以下步骤：
[0033]对权利要求1所述的SNP分子标记进行基因分型检测；将两种C/T基因型，或C/C基因型和CT基因型葡萄进行杂交，筛选C/C基因型的杂交后代。
[0034]一种鉴定葡萄抗寒性状的应用，以待检测葡萄的基因组DNA为模板，采用两种引物组合，利用外引物F和内引物R；内引物F和外引物R分别进行PCR扩增，其中PCR扩增反应使用的反应体系10u l记为：1000ng/uL基因组DNA 1uL，2
×
Taq Master M i x 5uL，PCR Pr imer mi x 1uL，去离子水补齐10uL；PCR扩增反应的扩增程序为；95℃5mi n；95℃30s；60℃30s；72℃30s，30个循环；72℃10mi n；4℃∞。
[0035]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0036]本专利技术首次提出一种适用于鉴定葡萄抗寒性状的SNP分子标记，该分子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记位于葡萄第2号染色体第8876325bp处，位于VvCML基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列中第148位碱基R为T/C，导致葡萄抗寒性出现多态性。2.根据权利要求1所述的一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记在鉴定葡萄抗寒性SNP芯片中的应用，其特征在于，该芯片的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，或者探针3'端的最末一个碱基，紧挨所述核苷酸序列SEQ ID NO.1中第148位碱基的SNP位点。3.根据权利要求2所述的一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记制备鉴定葡萄抗寒性的试剂盒或检测装置中的应用，其特征在于，包括用于特异性检测核苷酸序列SEQ ID NO.1，其序列中第148位碱基R为T/C一种或多种引物，或引物和探针的组合。4.根据权利要求2所述的一种葡萄抗寒性相关的SNP分子标记制备鉴定葡萄抗寒性的试剂盒或检测装置，其特征在于，所述引物和/或探针选自：用于测序检测的特异性引物和测序引物，所述引物的序列分别如外引物F、内引物R、内引物F、外引物R，具体如下；外引物F：5
’‑
ATGAGCGTGGATGAACCG
‑3’
内引物R：5
’‑
GTCCAGCTGCTCGGA
‑3’
内引物F：5
’‑
GGTCTGAAACCAAATC
‑3’
外引物R：5
’‑
CTAGGCCCATGAATTATCAA
‑3’
。5.根据权利要求1所述SNP分子标记的试剂在制备鉴定葡萄抗寒性的试剂盒或检测装置中的应用，其特征在于，包含：外引物F：5
’‑
ATGAGCGTGGATGAACCG
‑3’
内引物R：5
’‑
GTCCAGCTGCTCGGA
‑3’
内引物F：5
’‑
GGTCTGAAACCAAATC
‑3’
外引物R：5
’‑
CTAGGCCCATGAATTATCAA
‑3’
。6.根据权利要求1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭印山，马潇乐乐，林洪，姜长岳，侯洋明，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：