鉴别Fusariumgoolgardi产毒基因型的PCR-RFLP的引物及方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型的PCR

【技术实现步骤摘要】
鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型的PCR
‑
RFLP的引物及方法


[0001] 本专利技术属于镰刀菌产毒基因型鉴定
，具体涉及一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型的PCR
‑
RFLP的引物及方法。

技术介绍

[0002]镰刀菌属是引起世界范围内小麦、玉米、大麦等作物病害的重要病原真菌，给谷物生产造成巨大损失。除了造成严重的产量损失，镰刀菌产生的真菌毒素可以进入食物链进而威胁人畜健康，具有重大的食品和饲料安全隐患。
[0003]Fusarium goolgardi是近年来发现报道的一个镰刀菌新种（Laurence, M.H.; Walsh, J.L.; Shuttleworth, L.A.; Robinson, D.M.; Johansen, R.M.; Petrovic, T.; Vu, T.T.H.; Burgess, L.W.; Summerell, B.A.; Liew, E.C. Six novel species of Fusarium from natural ecosystems in Australia. Fungal Diversity, 2016, 77:349
‑
366.）。最新研究表明，在Fusarium goolgardi种群中存在至少两种不同的产毒基因型，即其中一部分Fusarium goolgardi菌株可以产T
‑
2毒素（此类菌株即为T
‑
2基因型），而另外一部分Fusarium goolgardi菌株只能产DAS毒素（此类菌株即为DAS基因型）。对两种不同基因型的Fusarium goolgardi菌株进行深入系统研究是当前面临的新的科学问题。
[0004]不同镰刀菌毒素存在显著的毒性差异，因此潜在的安全风险不同。如何有效对T
‑
2型和DAS型Fusarium goolgardi菌株进行区分鉴定，明确镰刀菌的产毒类型对开展病害流行、防控及真菌毒素污染风险评估具有重要意义。传统方法是对镰刀菌进行培养后提取毒素，然后进行色质谱分析，通过化学检测明确菌株的产毒类型。传统方法具有周期长、需要使用毒素标准品等有毒有害试剂、需要配置价格昂贵的大型色质谱仪器设备等缺点。因此，基于DNA序列多态性，开发镰刀菌产毒基因型快速鉴定方法，对进行真菌毒素污染风险评估及有针对性地开展病害及毒素污染防控工作具有重要意义。
[0005]目前，基于产毒基因（Tri基因）序列多态性已经开发建立了一些对镰刀菌进行产毒基因型分析的分子鉴定方法，并得到广泛应用。但是，至今未见有关鉴定Fusarium goolgardi种群T
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2和DAS产毒基因型的方法公开。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术中的不足，专利技术人开展了大量的前期研究工作，成功开发了一组基于PCR
‑
RFLP的Fusarium goolgardi产毒基因型分子鉴定方法及特异性引物，填补了相关空白，实现了技术突破。相较于传统的化学分析技术，该分子鉴定方法具有成本低、安全性高、通量高、速度快、不需要购置昂贵的色质谱仪器等诸多优点。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型PCR
‑
RFLP的引物，引物包括：Fgo
‑
Tri1F：5
′‑
AGCAAATCACCTACGCA/CGA
‑3′
（SEQ ID NO. 1），
Fgo
‑
Tri1R：5
′‑
TATCCTCCAACGCT/CAACCG
‑3′
（SEQ ID NO. 2）。
[0008]一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型的PCR
‑
RFLP的方法，其包括如下步骤：（1）、提取镰刀菌Fusarium goolgardi基因组DNA，以其为模板扩增Tri1基因的部分序列得到扩增基因片段，所用引物为上述序列的引物；（2）、使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或PCR产物回收试剂盒对步骤（1）所得扩增产物进行回收纯化；（3）、对步骤（2）所得纯化产物进行酶切；（4）、将步骤（3）所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对结果进行分析和判定。
[0009]优选地，步骤（1）中，基因组DNA的浓度为50
‑
200 ng/μL，进一步优选为100 ng/μL；引物Fgo
‑
Tri1F、Fgo
‑
Tri1R为Page纯化，引物的工作浓度为10 ng/μL。
[0010]优选地，步骤（1）中，扩增基因片段的长度为530 bp，PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，60 ℃复性20 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。
[0011]优选地，步骤（3）中，酶切时，使用特异性识别CTAG序列的限制性内切酶，酶切体系中各成分的量或工作浓度为：纯化产物1 μg、限制性内切酶2 U、1
×
限制性内切酶Buffer、无菌水补齐体系至20 μL，限制性内切酶最优反应温度37 ℃进行酶切反应，反应时间为1
‑
1.5h，酶切完成后，将酶切产物迅速置于冰上冷却。
[0012]优选地，限制性内切酶包括但不限于BfaI、MaeI、MthZI、RmaI。
[0013]优选地，步骤（4）中，琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖浓度为1
‑
2%。
[0014]优选地，步骤（4）中，结果的判定方法为：有明显两条DNA条带的Fusarium goolgardi菌株产毒基因型为DAS型，而只有一条DNA条带的Fusarium goolgardi菌株产毒基因型为T
‑
2型。
[0015]由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：1.相较于传统的化学分析技术，本专利技术的分子鉴定方法具有成本低、安全性高、操作简单、通量高、速度快、引物重复性好、不需要购置昂贵的色质谱仪器等诸多优点，从而能够用于快速鉴定Fusarium goolgardi菌株产毒基因型。
[0016]2.通过条带数量准确鉴别出DAS、T
‑
2基因型Fusarium goolgardi菌株，可选的限制性内切酶种类多，选择灵活，适用于Fusarium goolgardi菌株产毒基因型的快速鉴定，则使用本专利技术可快速、准确地对Fusarium goolgardi菌株产毒基因型进行鉴定，因而对其针对性地实施预测预报和防治、开展生物多样性研究及植物检验检疫等具有重要意义。
[0017]附图说明
[0018]图1为本专利技术的实施例中T
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2型和DAS型Fusarium goolgardi菌株Tri1基因扩增产物酶切后电泳图。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型PCR
‑
RFLP的引物，其特征在于：所述引物包括：Fgo
‑
Tri1F：5
′‑
AGCAAATCACCTACGCA/CGA
‑3′
（SEQ ID NO. 1），Fgo
‑
Tri1R：5
′‑
TATCCTCCAACGCT/CAACCG
‑3′
（SEQ ID NO. 2）。2.一种鉴别Fusarium goolgardi产毒基因型的PCR
‑
RFLP的方法，其特征在于：其包括如下步骤：（1）、提取镰刀菌Fusarium goolgardi基因组DNA，以其为模板扩增Tri1基因的部分序列得到扩增基因片段，所用引物为权利要求1所述序列的引物；（2）、使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或PCR产物回收试剂盒对步骤（1）所得扩增产物进行回收纯化；（3）、对步骤（2）所得纯化产物进行酶切；（4）、将步骤（3）所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对结果进行分析和判定。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述基因组DNA的浓度为50
‑
200 ng/μL，所述引物的工作浓度为10 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，杨宪立，杨俊花，王昇，赵志勇，王郝玉，张梦圆，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：