一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定的方法，采用通用引物GsSSR001，F:5'

【技术实现步骤摘要】
一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法


[0001]本专利技术属于食用菌分子标记辅助育种领域，具体涉及一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法。

技术介绍

[0002]作为一种典型的药用真菌，灵芝是我国医药上的瑰宝，素有“仙草”，“瑞草”之名，已被收录在《中国药典》之中，也是经国家批准的新资源食品，可药食两用。目前，市面上栽培最为广泛的种类为赤芝（Ganoderma sichuanensis），其富含多糖、萜类等多种药理活性成分，具有调节机体免疫活性、改善心脑血管功能、抗肿瘤、降血糖等诸多功效，应用前景广阔。食药用菌产业的健康发展，需要菌种质量的不断提升，因此优良品种的选育越来越受到人们的重视。
[0003]杂交育种是培育食药用菌高产优质新品种的重要手段。就单单杂交而言，涉及到大量的单核体菌株的获取、交配型鉴定、配对杂交及检测等多个环节，每一环节都涉及到显微镜检锁状联合的有无，此步骤对试验人员的专业性要求很强，且镜检过程耗时较长，效率较低。因此，开发一种手段简单且快速准确的方法辅助育种及其重要。另一方面，当前食用菌菌种市场较为混乱，同物异名、同名异物等情况相当普遍，食药用菌菌种可采用无性繁殖方式进行保存，优质品种流入市场后，很难控制其传播。因此高效、便捷的新品种鉴定手段对于育种工作者权益的保护十分迫切。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决上述问题，而本专利技术提供了一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法。
[0005]一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定的引物GsSSR001，包括：F: 5'
–
TTGCAAATGACCTTGCTCAG
–
3'R: 5'
–
CTTTCGATTGCTGCCTTGAT
–
3'一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法，它包括：（1）首先提取待测赤芝单双核杂交亲本及杂交子基因组DNA为模板；（2）采用权利要求1所述的引物GsSSR001进行PCR扩增；（3）对比扩增产物鉴定它们的亲缘关系。
[0006]所述的赤芝育种亲本为：“仙芝3号”（编号LP1）、“山东野生菌株”（编号LP2）和“湖北野生菌株”（编号LP3）。
[0007]所述的“仙芝3号”的等位位点1和2其碱基序列分别为：244bp和264bp；所述的“山东野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：248bp和272bp；所述的“湖北野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：238bp和258bp。
[0008]所述的“仙芝3号”的等位位点1和2其碱基序列分别为：如序列表SEQ ID NO.1和2所示；
所述的“山东野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：如序列表SEQ ID NO.3和4所示；所述的“湖北野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：如序列表SEQ ID NO.5和6所示。
[0009]所述的扩增产物采用毛细管电泳检测。
[0010]所述的PCR扩增体系为：10
×
PCR Buffer+Mg2+ 2μL、2.5mM dNTPs 2μL、20 pM上游引物0.3μL、20 pM下游引物0.3μL、基因组DNA 0.3μL、5U/uL Taq DNA Polymerase 0.2μL，用ddH2O 将总体积补足至20μL；所述的PCR 反应程序为 ：94
°
C预变性5 min，94
°
C变性30s，57
°
C退火30s， 72
°
C延伸30s，循环30次，最后72
°
C延伸10min。
[0011]本专利技术提供了一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定的引物和方法，利用特异引物GsSSR001，对赤芝双核、单核杂交亲本及杂交子菌株的基因组DNA进行PCR扩增。双核亲本菌株能同时扩增出双条带，对应单核菌株能特异性的扩增出与双核菌株双条带的其中一条条带对应大小的单一条带；杂交子能特异性的同时扩增出与其两个单核亲本条带大小一致的双条带。
[0012]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一组特异性SSR引物，可在目标赤芝单双核杂交亲本及杂交子中表现出特定的带型，从而对它们进行准确清晰的鉴别。本专利技术不受时间、环境、菌种状态（菌丝体或者子实体任何部位）的限制，只需要少量组织即可获得基因组DNA并完成后续检测。应用本专利技术的方法，可在短时间内完成大量样本的快速检测，操作简单，结果准确，通用型较好，可适用于90%的赤芝菌株，能够加速赤芝杂交育种进程。同时可对杂交子及其亲本进行特异性标记，实现与其他菌种的快速区分，对目标菌种进行保护。
附图说明
[0013]图1灵芝单双核亲本、单核交配型及杂交子在位点I的基因型。A为双核亲本菌种“仙芝3号”（编号LP1），其在位点I为杂合型，能扩增出双条带（244 bp，264 bp）；B和C为A的两种单核体LP1
‑
1和LP1
‑
2，分别对应264 bp和244 bp的单条带。
[0014]图2 D为双核亲本菌种“山东野生菌株”（编号LP2），其在位点I为杂合型，能扩增出双条带（248 bp，272 bp）；E和F为D的两种单核体LP2
‑
1和LP2
‑
2，分别对应272 bp和248 bp的单条带。
[0015]图3 G为双核亲本菌种“湖北野生菌株”（编号LP3），其在位点I为杂合型，能扩增出双条带（238 bp，258 bp）；H和I为D的两种单核体LP3
‑
1和LP3
‑
2，分别对应238 bp和258 bp的单条带。
[0016]图4、5、6、7 J
‑
U依次为杂交子LP1
‑1×
LP2
‑
1、LP1
‑1×
LP2
‑
2、LP1
‑1×
LP3
‑
1、LP1
‑1×
LP3
‑
2、LP1
‑2×
LP2
‑
1、LP1
‑2×
LP2
‑
2、LP1
‑2×
LP3
‑
1、LP1
‑2×
LP3
‑
2、LP2
‑1×
LP3
‑
1、LP2
‑1×
LP3
‑
2、LP2
‑2×
LP3
‑
1和LP2
‑2×
LP3
‑
2，均能同时扩增出两种对应单核亲本的条带类型。
[0017]实施例1引物的设计基于本课题组完成的“仙芝3号”灵芝单核菌株的全基因组序列，利用MIcroSAtellite（MISA，http://pgrc.ipk
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定的引物GsSSR001，包括：F: 5'
–
TTGCAAATGACCTTGCTCAG
–
3'R: 5'
–
CTTTCGATTGCTGCCTTGAT
–
3'。2.一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法，它包括：（1）首先提取待测赤芝单双核杂交亲本及杂交子基因组DNA为模板；（2）采用权利要求1所述的引物GsSSR001进行PCR扩增；（3）对比扩增产物鉴定它们的亲缘关系。3.根据权利要求2所述的一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法，其特征在于：所述的赤芝育种亲本为：“仙芝3号”、“山东野生菌株”和/或“湖北野生菌株”。4.根据权利要求3所述的一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法，其特征在于：所述的“仙芝3号”的等位位点1和2其碱基序列分别为：244bp和264bp；所述的“山东野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：248bp和272bp；所述的“湖北野生菌株”的等位位点1和2其碱基序列分别为：238bp和258bp。5.根据权利要求4所述的一种赤芝育种亲本及杂交后代单双核鉴定方法，其特征在于：所述的“仙芝3号”的等位位点1和2...

【专利技术属性】
技术研发人员：付永平，李振皓，李明焱，李玉，李振宇，王瑛，袁晓辉，徐靖，肖世俊，
申请(专利权)人：金华寿仙谷药业有限公司浙江寿仙谷植物药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：