一种米曲霉工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及羊毛甾醇的制备技术领域，公开了一种米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌体内携有表达质粒pRA

【技术实现步骤摘要】
一种米曲霉工程菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及羊毛甾醇的制备
，具体涉及一种可用大米生产羊毛甾醇的米曲霉工程菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]羊毛甾醇属于四环三萜类化合物，在预防和治疗白内障方面发挥至关重要的作用，是一种新型的白内障预防和治疗策略。同时，它还是灵芝酸、麦角甾醇及具有多种生物活性三萜类化合物的前体。因此，羊毛甾醇在临床药物开发和三萜类天然化合物生物合成机制过程的研究中，具有十分重要的地位和作用。
[0003]目前，市售的高纯度羊毛甾醇(97％以上)售价高达10～20万元/g，高昂的价格阻碍了羊毛甾醇的相关研究及应用。现有羊毛甾醇多为以链状的角鲨烯为原料通过化学合成方法的制备，存在纯度低、收率低及合成工艺复杂的问题。中国专利申请202210527268.5，专利名称“代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用”，公开了将酿酒酵母改造为生产羊毛甾醇工程菌株，将其接种至发酵培养基中发酵培养制备羊毛甾醇的技术方案。但是，该技术方案中所用发酵培养基为酵母缺陷型SD
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URA
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MET
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LEU培养基，可能面临培养基来源窄、羊毛甾醇产量不高等问题。

技术实现思路

[0004]针对商业化羊毛甾醇售价高，而传统制备方法存在收率低等问题，本专利技术的目的在于提供一种可用大米生产羊毛甾醇的米曲霉工程菌，可以大米为底物高效发酵制备羊毛甾醇，羊毛甾醇产量可以达到189mg/1kg大米。
[0005]本专利技术提供如下的技术方案：一种米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌体内携有表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS，其中：HMGR为3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；GLLS为羊毛甾醇合酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]本专利技术以米曲霉为出发菌株构建米曲霉工程菌，米曲霉具有高效分解淀粉的能力，所用的表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS上携带pAmyB淀粉酶启动子，以大米为培养基时可以高效驱动羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的高效表达。
[0007]上述米曲霉工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS的构建；(1
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1)以燕麦的cDNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，扩增获得3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段；(1
‑
2)以pRA质粒经NheI酶切线性化处理的片段为载体，将3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA
‑
HMGR；(1
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3)以灵芝的cDNA为模板，以P2F为正向引物、P2R为反向引物，核苷酸序列分别
如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，扩增获得羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段；(1
‑
4)以pRA
‑
HMGR质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段插入到pRA
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HMGR质粒中，获得表达质粒pRA
‑
HMGR
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GLLS；(2)制备米曲霉工程菌株(A.oryzae/pRA
‑
HMGR
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GLLS)；(2
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1)取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，振荡2～3小时，获得原生质体；(2
‑
2)向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS，混匀后冰浴10～20min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10～20min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10～20min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；(2
‑
3)待含有pRA
‑
HMGR
‑
GLLS转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行至少2次继代培养后，获得携有表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS的米曲霉工程菌。
[0008]作为本专利技术方法的优选，步骤(1
‑
2)中，将3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码的基因HMGR片段及经NheI酶切线性化处理的pRA质粒片段按照(1～2)：2的摩尔比混合，利用单片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA
‑
HMGR；步骤(1
‑
4)中，将羊毛甾醇合酶编码的基因GLLS片段及经KpnI酶切线性化处理的pRA
‑
HMGR质粒片段按照(1～2)：2的摩尔比混合，利用单片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS。
[0009]作为本专利技术方法的优选，步骤(1
‑
2)中，以pRA质粒经NheI酶切线性化处理的片段为载体，利用非连接酶依赖型的单片段一步克隆试剂盒，将3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段插入pRA质粒中，得表达质粒pRA
‑
HMGR，pRA质粒质量与NheI酶体积比为1μg：(1～2)μL；步骤(1
‑
4)中，以pRA
‑
HMGR质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，利用非连接酶依赖型的单片段一步克隆试剂盒，将羊毛甾醇编码基因GLLS的片段插入pRA
‑
HMGR质粒中，获得表达质粒pRA
‑
HMGR
‑
GLLS，pRA
‑
HMGR质粒质量与KpnI酶体积比为1μg：(1～2)μL。
[0010]作为本专利技术方法的优选，步骤(2
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1)中，取米曲霉的孢子保存液接入到100～200mL的DPY培养基中，在28～30℃、180～200rpm的转速振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；将米曲霉菌丝体过滤收集后用无菌水洗涤3～5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种米曲霉工程菌，其特征在于，所述米曲霉工程菌体内携有表达质粒pRA
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HMGR
‑
GLLS，其中：HMGR为3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；GLLS为羊毛甾醇合酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的米曲霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS的构建；（1
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1）以燕麦的cDNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，扩增获得3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段；（1
‑
2）以pRA质粒经NheI酶切线性化处理的片段为载体，将3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA
‑
HMGR；（1
‑
3）以灵芝的cDNA为模板，以P2F为正向引物、P2R为反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，扩增获得羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段；（1
‑
4）以pRA
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HMGR质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段插入到pRA
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HMGR质粒中，获得表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS；（2）制备米曲霉工程菌株；（2
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1）取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2~3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，振荡2~3小时，获得原生质体；（2
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2）向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS，混匀后冰浴10~20 min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10~20 min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10~20 min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3~7天；（2
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3）待含有pRA
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HMGR
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GLLS转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行至少2次继代培养后，获得携有表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS的米曲霉工程菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1
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2）中，将3
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羟基
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甲基戊二酰辅酶A还原酶编码的基因HMGR片段及经NheI酶切线性化处理的pRA质粒片段按照（1～2）：2的摩尔比混合，利用单片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA
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HMGR；步骤（1
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4）中，将羊毛甾醇合酶编码的基因GLLS片段及经KpnI酶切线性化处理的pRA
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HMGR质粒片段按照（1~2）：2的摩尔比混合，利用单片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA
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HMGR
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GLLS。4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振皓，彭爽，李明焱，王瑛，李振宇，徐靖，刘成伟，
申请(专利权)人：金华寿仙谷药业有限公司浙江寿仙谷植物药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：