高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高产ε

【技术实现步骤摘要】
高产
ε
‑
聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及基因工程菌株构建方法及应用，尤其是一种高产ε
‑
聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]ε
‑
聚赖氨酸(ε
‑
Poly
‑
L
‑
lysine，ε
‑
PL)是由25～35个L
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赖氨酸单体通过α
‑
COOH和ε
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NH2脱水缩合而成的天然氨基酸同聚物。ε
‑
聚赖氨酸及其盐酸盐具有抗菌谱广、热稳定性和水溶性好，对人体安全无毒，除在食品保鲜和防腐领域极具开发潜力，还可用作药物包被物、化妆品、药物载体等。
[0003]为了提高ε
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聚赖氨酸产量、降低生产成本，前期相关研究多从发酵工艺优化和诱变育种等方面出发。而通过构建ε
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聚赖氨酸高产工程菌株的报道和研究则本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产ε
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聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述工程菌为淀粉酶产色链霉菌dapE(StreptomycesdiastatochromogenesdapE)，所述淀粉酶产色链霉菌dapE是将二氨基庚二酸途径DAP中的琥珀酰二氨基庚二酸脂脱琥珀酸酶基因dapE在S.diastatochromogenes6#
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7中过量表达得到的，过表达的dapE基因核苷酸序列与SEQ ID No.1具有83.9％及以上的一致性。2.根据权利要求1所述的高产ε
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聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述S.diastatochromogenes6#
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7的保藏编号为：CGMCCNo.22261，保藏日期：2021年4月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。3.如权利要求1或2所述的高产ε
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聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)过表达基因dapE，基因dapE的核苷酸序列与SEQ ID No.1具有83.9％及以上的一致性；(2)通过PCR技术扩增或直接合成dapE基因；(3)构建中使用的过表达质粒是带有有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP。4.根据权利要求3所述的高产ε
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聚赖氨酸及其盐酸盐链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：(1)提取S.diastatochromogenes6#
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7的基因组并以其为模板，采用PCR技术扩增目的基因，目的基因为琥珀酰二氨基庚二酸脂脱琥珀酸酶基因dapE；或者是根据NCBI检索得到的其他链霉菌具有相同功能的dapE核苷酸序列直接合成；(2)将步骤(1)得到的目的基因dapE插入整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP的酶切位点间，得到携带目的基因重组质粒pIMEP::dapE，并将重组质粒pIMEP::dapE转化到大肠杆菌DH5α中，筛选得到大肠杆菌DH5α阳性转化子；(3)提取步骤(2)大肠杆菌DH5α阳性转化子中的重组质粒pIMEP::dapE，首先将提取的重组质粒pIMEP::dapE转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，涂布于含有20
‑
25ng/μL卡那霉素、30
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50ng/μL安普霉素和20
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25ng/μL氯霉素的LB平板上，挑选大肠杆菌ET12567(pUZ8002)阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37
‑
40℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的LB液体培养基中，180r/min，37
‑
40℃振荡培养至OD
600
＝0.4至0.6之间，离心收集菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2
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3次以除去残余的抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)阳性转化子细胞；(4)向贝纳特培养基上产孢的S.diastatochromogenes6#
‑
7菌株平板上加入pH＝8.0的TES缓冲液，刮下S.diastatochromogenes6#
‑
7孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，过滤除去菌丝，收集孢子悬液，水浴热激后将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37
‑
40℃条件下振荡培养2
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3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集S.diastatochromogenes6#
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7萌发孢子，重悬备用；(5)将步骤(3)的阳性转化子大肠杆菌ET12567(pUZ8002)和步骤(4)的S.diastatochromogenes6#
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7萌发孢子等体积混合，均匀涂布于含有5
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8mMMg
2+
的SFM培养基上，30℃倒置培养14
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18h后，用含浓度为20
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25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为20
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25mg/mL的
安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3
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5天，筛选阳性单克隆接合子，获得所述的高产工程菌。5.根据权利要求4所述的高产ε
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【专利技术属性】
技术研发人员：谭之磊，周东浩，贾士儒，侯颖，裴泽峰，许倍铭，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：