敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明专利技术采用裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21为原始菌株，通过基因工程手段在大肠杆菌中构建敲除载体，以PLD基因的上下游序列作为同源臂，以博来霉素基因替换PLD基因并作为筛选抗性基因，得到一株高产DHA的基因工程菌株，为基因工程调控裂殖壶菌高产DHA提供了新的思路。程调控裂殖壶菌高产DHA提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】
敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]裂殖壶菌(Schizochytrium)作为多不饱和脂肪酸(PUFAs)的优质生产者，因其生长速度快、油脂含量高、DHA比例高，是工业化生产PUFAs和DHA的代表性菌株。国内外科学家对于裂殖壶菌中PUFAs的合成机制进行了广泛的研究，发现裂殖壶菌PUFAs合成的途径包括脂肪酸合成酶(FAS)途径和聚酮合成酶(PKS)途径，其中裂殖壶菌DHA合成被认为主要与PKS途径有关。最近的研究发现裂殖壶菌中DHA的生产不仅仅取决于DHA的合成过程，还取决于DHA合成后迁移、积累和储存的装配形式。裂殖壶菌中DHA的储存形式主要为甘油三酯，还有的是以磷脂和甾醇酯形式存在，甘油酯、磷脂和甾醇酯相互转化的过程中也会伴随着脂肪酸的迁移，其过程与磷脂代谢密切相关。因此优化裂殖壶菌的磷脂代谢过程对于裂殖壶菌DHA合成具有重要意义。
[0003]磷脂酶D专一性水解磷脂中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株是选用Schizochytrium limacinum SR21为原始菌株构建而成，所述基因工程菌株的基因组中磷脂酶D基因被敲除。2.一种权利要求1所述的敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括：1)以Schizochytrium limacinum SR21基因组为模板，设计如SEQ ID No.3～SEQ ID No.6所示的引物；2)以步骤1)所述的引物克隆来源于Schizochytrium limacinum SR21基因组的PLD基因的上下游序列作为同源臂，将得到的PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂插入到pBlue
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zeo敲除载体的同源重组区域，构建PLD基因敲除载体pBlue
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zeo
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PLD；3)将构建好的PLD基因敲除载体pBlue
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zeo
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PLD的同源重组区域线性化，电转化至Schizochytrium limacinum SR21的基因组中进行同源重组，获得敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株。3.一种权利要求1所述的敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株在合成DHA中的应用。4.一种应用权利要求1所述的敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株生产DHA的方法，其特征在于：将所述敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基进行培养；收集菌体获得油脂组分DHA。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：将敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于固体种子培养基上，在27～29℃条件下静置培养，进行活化；将活化后的种子接种至液体种子培养基，在27～29℃，150～250rpm条件下培养，得到一级种子；将所述一级种子以2％～10％的接种量接种至液体种子培...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌雪萍，李科燕，卢英华，崔潇文，陈翠雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：