乳酸脱氢酶及其编码基因、重组载体、重组菌体和发酵剂以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，公开了一种乳酸脱氢酶及其编码基因、重组载体、重组菌体和发酵剂以及它们的应用。所述乳酸脱氢酶为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶，或者为SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第247位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有乳酸脱氢酶活性的氨基酸序列所示的酶，该乳酸脱氢酶在不对称还原苯丙酮酸钠过程中的催化活力和热稳定性明显提高，与野生型乳酸脱氢酶相比，催化效率(k

【技术实现步骤摘要】
乳酸脱氢酶及其编码基因、重组载体、重组菌体和发酵剂以及它们的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种乳酸脱氢酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种制备D
‑
苯基乳酸的方法，以及它们在制备D
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苯基乳酸中的应用。

技术介绍

[0002]苯基乳酸存在于蜂蜜、酸面团和乳酸菌发酵食品中，是一种天然有机酸，它具有广谱抗菌活性，能抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌等微生物的生长，其水溶性好，耐高温，作用pH较宽，安全无毒，可在防止食品腐败、保留营养品质的同时，维持食品的风味，因此可作为抗菌剂和防腐剂应用于食品工业。此外，苯基乳酸也可作为饲料添加剂，增加家禽产蛋率和禽蛋品质；或者作为抗皱剂和抑菌剂添加到化妆品中。苯基乳酸分子中含有一个手性碳原子，因而存在一对对映异构体，其中D
‑
苯基乳酸的抗菌活性较强，并且还可作为前体，合成降血糖药恩格列酮和冠心病治疗药物丹参素，因此，D
‑
苯基乳酸获得了较多关注。D
‑
苯基乳酸在食品、饲料、制药、化妆品等行业的广阔应用前景激发了学术界和产业界对其合成方法的研究热情。
[0003]多种乳酸菌可通过细胞内代谢途径合成苯基乳酸，但其发酵周期长，产率低，产物光学纯度较差，制约了D
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苯基乳酸的大规模发酵生产。在乳酸菌代谢途径中，苯丙酮酸钠是苯基乳酸的直接前体，通过乳酸脱氢酶的不对称还原获得D
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苯基乳酸。酶是具有生物催化功能的生物大分子，酶分子介导的生物催化反应具有催化活性高，立体选择性好，反应条件温和，副产物少，环境友好等特点，符合绿色化学合成的发展方向，正日益成为传统化学合成法的重要补充，广泛地应用于医药、农药、食品、化妆品和其他精细化工品的生产。以苯丙酮酸钠为底物，在乳酸脱氢酶催化作用下一步还原，是制备D
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苯基乳酸最普遍采用的方法。
[0004]通过基因挖掘已获得多种乳酸脱氢酶及其编码基因，能够催化苯丙酮酸钠不对称还原合成D
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苯基乳酸，产物对映体过量值(e.e.)大于99％，但现有的乳酸脱氢酶的催化活性和热稳定性较低，从而限制了其工业化应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的乳酸脱氢酶对苯丙酮酸钠不对称还原活性较低的问题，提供一种乳酸脱氢酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种制备D
‑
苯基乳酸的方法，以及它们在制备D
‑
苯基乳酸中的应用，该乳酸脱氢酶具有更高的催化活性和更出色的热稳定性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种乳酸脱氢酶，所述乳酸脱氢酶为(a)
‑
(d)中任意一项所述的酶：
[0007](a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
[0008](b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第247位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基
酸残基且仍具有乳酸脱氢酶活性的氨基酸序列所示的酶；
[0009](c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
[0010](d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
[0011]优选地，所述乳酸脱氢酶为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第247位苏氨酸取代为异亮氨酸的氨基酸序列所示的酶。
[0012]本专利技术第二方面提供一种编码乳酸脱氢酶的基因，该基因具有编码上述的乳酸脱氢酶的核苷酸序列。
[0013]优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
[0014]更优选地，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0015]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的基因。
[0016]优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。
[0017]本专利技术第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因或者上述的重组载体。
[0018]优选地，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
[0019]更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌。
[0020]本专利技术第五方面提供一种发酵剂的制备方法，该制备方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵得到发酵液，对所述发酵液进行固液分离，得到湿菌体。
[0021]本专利技术第六方面提供上述的乳酸脱氢酶、上述的基因、上述的重组载体、上述的重组菌株和上述的制备方法制得的发酵剂中的至少一种在制备D
‑
苯基乳酸中的应用。
[0022]本专利技术第七方面提供一种制备D
‑
苯基乳酸的方法，该方法包括以下步骤：将上述的乳酸脱氢酶、上述的基因、上述的重组载体、上述的重组菌株和上述的制备方法制得的发酵剂中的至少一种与苯丙酮酸钠接触。
[0023]优选地，所述接触的过程包括：在辅助底物和反应介质存在的条件下，将所述发酵剂与苯丙酮酸钠混合后在温度为25
‑
45℃，转速为150
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250rpm的条件下反应至所述苯丙酮酸钠反应完全。
[0024]优选地，所述辅助底物选自葡萄糖、6
‑
磷酸葡萄糖和异丙醇中的至少一种，更优选为葡萄糖；所述反应介质采用pH为6.0
‑
8.0的磷酸钾缓冲液。
[0025]优选地，相对于1L所述反应介质，所述苯丙酮酸钠的用量为1
‑
100g，所述辅助底物的用量为5
‑
300g，所述发酵剂的用量为10
‑
250g。
[0026]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0027]本专利技术提供的乳酸脱氢酶在不对称还原苯丙酮酸钠过程中的催化活力和热稳定性明显提高，与野生型乳酸脱氢酶相比，催化效率(k
cat
/K
m
)提高约2.4倍，热稳定性能显著提升(50℃下半衰期t
1/2
延长近5倍；半失活温度升高19℃)。本专利技术所提供的乳酸脱氢酶特别适合于催化苯丙酮酸钠不对称还原制备D
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苯基乳酸，具有较好的工业应用前景。
附图说明
[0028]图1是实施例3中SDS
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PAGE电泳图，其中，M为蛋白Marker；1、4、7为E.coli/pET28a
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lrldh、E.coli/pET28a
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lrldh
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D249A和E.coli/pET28a
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lrldh
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D249A/T247I经诱导表达后的可溶部分；2、5、8为E.coli/pET28a
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lrldh、E.coli/pET28a
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lr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳酸脱氢酶，其特征在于，所述乳酸脱氢酶为(a)
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(d)中任意一项所述的酶：(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第247位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有乳酸脱氢酶活性的氨基酸序列所示的酶；(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。2.根据权利要求1所述的乳酸脱氢酶，其特征在于，所述乳酸脱氢酶为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第247位苏氨酸取代为异亮氨酸的氨基酸序列所示的酶。3.一种编码乳酸脱氢酶的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的乳酸脱氢酶的核苷酸序列；优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；更优选地，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的基因；优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求2或3所述的基因或者权利要求4所述的重组载体；优选地，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌；更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌。6.一种发酵剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将权利要求5所述的重组菌株接种至发酵培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗希，付永前，呼高伟，尹龙飞，尹丰伟，孙小龙，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：