通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株及其构建方法和应用。该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株含有与角鲨烯合酶连接的编码蛋白降解子的基因以及编码辅助蛋白的基因，所述角鲨烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。发酵产赤霉素GA3的方法包括：将该重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。该重组菌株能够在生物素的作用下有效下调角鲨烯的生物合成，提高赤霉素GA3的产量。提高赤霉素GA3的产量。提高赤霉素GA3的产量。

【技术实现步骤摘要】
通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体地，涉及一种通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]赤霉素3(GA3)是一种二萜类羧酸，属于赤霉素家族，是一种天然的植物生长激素。GA3是目前最畅销和最重要的植物生长调节剂(PGR)之一，已被广泛应用于杂交水稻制种、柑橘保果、棉花保龄、蔬菜及幼树生长等方面，对于促进农林业生产，特别是粮食生产及林木扦插扩繁有很大的经济效益和社会效益。
[0003]GA3的生产方式主要包括植物提取法、化学合成法和微生物发酵法3种方法，工业化应用中主要采用微生物发酵生产GA3，由于其具有周期短、效率高等优点受到人们的青睐。然而，面对日益增长的市场需要，提高赤霉素GA3产量的研究大多仍集中在诱变筛选高产菌株、优化培养基等方面，但是，诱变筛选所花费的时间较长，难以掌握诱导突变的方向，突变体难以集中多种理想性状，发酵调控只能有限地提高赤霉素GA3的产量，不能从根本上解决问题。
[0004]随着合成生物学技术的不断发展，通过代谢工程改造萜类途径以提高赤霉素GA3产量成为最有潜力的方法。然而，到目前为止，在藤仓赤霉菌中还没有通过下调角鲨烯合成通量，以提高赤霉素GA3产量的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株的构建方法及其应用，该重组菌株能够有效下调角鲨烯的生物合成，提高赤霉素GA3的产量。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株含有与角鲨烯合酶连接的编码蛋白降解子的基因以及编码辅助蛋白的基因，所述角鲨烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]优选地，所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌。
[0009]优选地，所述编码蛋白降解子的基因为AID基因，所述AID基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]优选地，所述辅助蛋白为F
‑
box蛋白。
[0011]优选地，所述编码辅助蛋白的基因为TIR1基因或AFB2基因；更优选为TIR1基因，所述TIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]本专利技术第二方面提供一种构建通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3
含量的重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株含有与角鲨烯合酶连接的编码蛋白降解子的基因以及编码辅助蛋白的基因，所述角鲨烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]优选地，所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌。
[0015]优选地，所述编码蛋白降解子的基因为AID基因，所述AID基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]优选地，所述辅助蛋白为F
‑
box蛋白。
[0017]优选地，编码所述辅助蛋白的基因为TIR1基因或AFB2基因；更优选为TIR1基因，所述TIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]本专利技术第三方面提供前述的重组菌株或前述的方法在制备赤霉素GA3中的应用。
[0019]本专利技术第四方面提供一种发酵产赤霉素GA3的方法，该方法包括：将前述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照前述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；其中，所述发酵过程中添加能够与所述辅助蛋白结合的生长素。
[0020]优选地，所述生长素为萘乙酸和/或吲哚乙酸，所述生长素的添加量为0.5
‑
20mM。
[0021]优选地，所述生长素的添加时间为发酵开始后0
‑
96h。
[0022]优选地，所述发酵的条件包括：接种量为8
‑
12体积％，温度为20
‑
35℃，转速为180
‑
220rpm，时间为6
‑
8天。
[0023]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0024]本专利技术提供的重组菌株在藤仓赤霉菌中建立了生长素诱导的蛋白质降解系统，能够在发酵过程中与生长素相配合，有效地降解目标蛋白角鲨烯合酶，用于下调角鲨烯的生物合成，从而显著提高赤霉素GA3的产量，与传统的方法相比具有明显的优势。本专利技术的发酵成本较低、可缩短生产周期，且具有原料再生、条件温和、绿色生产，不受时间、地点约束等优点。
附图说明
[0025]图1是实施例1中模板质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph的结构图；
[0026]图2是实施例1中重组质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph
‑
N20的结构图；
[0027]图3是实施例1中重组质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph
‑
N20
‑
dn的结构图；
[0028]图4是实施例1中重组质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph
‑
N20
‑
dn
‑
TIR1的结构图；
[0029]图5是实施例1中重组质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph
‑
N20
‑
HR
‑
TIR1
‑
AID的结构图；
[0030]图6是对比例1中重组质粒pUC
‑
fFuCas9
‑
HTBNLS
‑
hph
‑
N20
‑
HR
‑
TIR1的结构图；
[0031]图7是实施例3中重组菌株I在发酵过程中降解角鲨烯合酶的原理图，其中，Rbx1为协助识别赖氨酸残基的蛋白因子。
具体实施方式
[0032]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各
个范围本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株含有与角鲨烯合酶连接的编码蛋白降解子的基因以及编码辅助蛋白的基因，所述角鲨烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述编码蛋白降解子的基因为AID基因，所述AID基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述辅助蛋白为F
‑
box蛋白；优选地，所述编码辅助蛋白的基因为TIR1基因或AFB2基因；更优选为TIR1基因，所述TIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种构建通过蛋白降解下调角鲨烯含量用于提高赤霉素GA3含量的重组菌株的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株含有与角鲨烯合酶连接的编码蛋白降解子的基因以及编码辅助蛋白的基因，所述角鲨烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述出发...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，施天穹，郭琪，聂志奎，
申请(专利权)人：江西新瑞丰生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：