生产脱落酸的重组菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物基因改造技术，公开了一种生产脱落酸的重组菌株及其构建方法和应用。该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的HMG

【技术实现步骤摘要】
生产脱落酸的重组菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物基因改造技术，具体地，涉及一种生产脱落酸的重组菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]脱落酸(Abscisic acid)是一种重要的植物激素，广泛存在于高等植物中，在植物的生长发育过程中起着重要的调节作用，并且可提高植物应对各种生物或非生物胁迫的耐受性，如增强农作物抗旱、抗病虫害、抗寒等能力，从而提高农作物的品质和产量。此外，脱落酸也在后生动物和哺乳动物中被发现，经研究表明，脱落酸不仅能调节血糖和炎症，还对动物的肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和炎症性疾病具有良好的治疗效果。因此，脱落酸作为营养保健品和药物具有巨大的潜力。随着对脱落酸作用机制及应用技术的深入研究，脱落酸实用制剂的市场将会逐渐打开，这将带来巨大的经济效益和社会效益。
[0003]目前工业上主要以灰葡萄孢霉菌等丝状真菌深层发酵技术来生产脱落酸，然而现有菌种仍存在底物转化率低、合成脱落酸的前体物质供应速率不足等问题，限制了脱落酸的产量。已有研究采用发酵过程中添加关键底物的方式调控脱落酸的产量，例如，CN102399827A公开了一种新的灰葡萄孢霉菌并在发酵过程中流加合成脱落酸的前体物质乙酰辅酶A，促进脱落酸的合成，但乙酰辅酶A价格相对昂贵，不利于节约成本。在微生物的生长和代谢过程中，氧气作为细胞呼吸的底物，参与细胞能量代谢以及产物合成的后期氧化过程。适宜的氧气供应可以改善溶氧浓度，并提供细胞所需的氧化能力，从而促进菌丝的生长和产物的合成。然而，灰葡萄孢霉菌等丝状真菌发酵过程中菌体呈丝状增长，且油脂类副产物较多，导致发酵液非常粘稠，局部供氧不足，成为限制脱落酸生物合成的主要因素之一。因此，寻找一种提高微生物在贫氧环境下的摄氧能力的方法成为目前脱落酸发酵生产中亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的发酵生产脱落酸时产量受限的问题，提供一种生产脱落酸的重组菌株及其构建方法和应用，该重组菌株能够高效、稳定地发酵生产脱落酸，产量较高且发酵成本较低。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种生产脱落酸的重组菌株，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的HMG
‑
CoA还原酶的活性增强且表达血红蛋白VHB；其中，所述重组菌株中含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HMG
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CoA还原酶的基因以及编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的血红蛋白VHB的基因。
[0006]优选地，所述编码HMG
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CoA还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0007]优选地，所述编码血红蛋白VHB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]优选地，所述出发菌株为灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)。
[0009]本专利技术第二方面提供一种构建生产脱落酸的重组菌株的方法，该方法包括：将出
发菌株进行遗传改造以使出发菌株的HMG
‑
CoA还原酶的活性增强且表达血红蛋白VHB；其中，使出发菌株的HMG
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CoA还原酶的活性增强的方式为过表达编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HMG
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CoA还原酶的基因；使出发菌株表达血红蛋白VHB的方式为外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的血红蛋白VHB的基因。
[0010]优选地，所述编码HMG
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CoA还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0011]优选地，所述编码血红蛋白VHB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0012]优选地，所述出发菌株为灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)。
[0013]本专利技术第三方面提供上述的重组菌株或上述的方法在制备脱落酸中的应用。
[0014]本专利技术第四方面提供一种发酵生产脱落酸的方法，该方法包括：将上述的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵培养；
[0015]或者，按照上述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵培养。
[0016]优选地，所述重组菌株以种子液的形式接种至所述产酸发酵培养基中。
[0017]优选地，所述种子液的制备过程包括：将所述重组菌株的单菌落接种至种子培养基中进行种子培养。
[0018]优选地，所述种子培养基含有：葡萄糖20
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30g/L，麦麸70
‑
90g/L，硫酸镁0.5
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1.5g/L，磷酸二氢钾0.5
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1.5g/L，硝酸铵0.3
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1g/L。
[0019]优选地，所述种子培养的条件至少包括：温度为20
‑
25℃，转速为150
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200rpm，时间为48
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72h。
[0020]优选地，所述产酸发酵培养基含有：葡萄糖20
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30g/L，酵母提取物5
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15g/L，麦麸70
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90g/L，硫酸镁0.5
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1.5g/L，磷酸二氢钾0.5
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1.5g/L，维生素B
1 0.02
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0.06mg/L。
[0021]优选地，所述发酵培养的条件至少包括：接种量为4
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8体积％，温度为20
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25℃，转速为150
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200rpm，时间为150
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200h。
[0022]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术提供的重组菌株通过增强内源甲羟戊酸途径中关键限速酶HMG
‑
CoA还原酶的表达，提高乙酰辅酶A前体供应，并引入外源血红蛋白VHB的基因，显著增强发酵过程中的溶氧水平，使菌株能够在发酵后期更加高效地利用营养物质合成脱落酸，两者相互协同增效，增强脱落酸的合成途径，从而显著提高脱落酸的生产能力，使得重组菌株发酵生产脱落酸的产量高、成本低，可应用于大规模的脱落酸生产中。
附图说明
[0024]图1是实施例1中pHPH
‑
HMGR重组载体的质粒图谱；
[0025]图2是实施例2中pHPH
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VHB重组载体的质粒图谱；
[0026]图3是实施例3中pHPH
‑
HMGR
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VHB重组载体的质粒图谱；
[0027]图4是实施例4中各重组菌株和出发菌株的发酵液中脱落酸的含量图；
[0028]图5是实施例5中重组菌株B.cinerea
‑
OE:HMGR OE:VHB传代培养时发酵液中脱落酸的含量图。
具体实施方式
[0029]在本文中所披本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产脱落酸的重组菌株，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的HMG
‑
CoA还原酶的活性增强且表达血红蛋白VHB；其中，所述重组菌株中含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HMG
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CoA还原酶的基因以及编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的血红蛋白VHB的基因。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述编码HMG
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CoA还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选地，所述编码血红蛋白VHB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)。4.一种构建生产脱落酸的重组菌株的方法，其特征在于，该方法包括：将出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的HMG
‑
CoA还原酶的活性增强且表达血红蛋白VHB；其中，使出发菌株的HMG
‑
CoA还原酶的活性增强的方式为过表达编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HMG
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CoA还原酶的基因；使出发菌株表达血红蛋白VHB的方式为外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的血红蛋白VHB的基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述编码HMG
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CoA还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选地，所述编码血红蛋白VHB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述出发菌株为灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)。7.权利要求1至3中任意一项所述的重组菌株或权利要求4至6中任意一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，施天穹，王伶如，聂志奎，
申请(专利权)人：江西新瑞丰生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：