高产ε-聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株及方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种同时过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF和二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的高产ε

【技术实现步骤摘要】
高产
ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株及方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其是一种构建多基因过表达淀粉酶产色链霉菌菌株、方法及提高ε
‑
聚赖氨酸产量的方法与应用。

技术介绍

[0002]ε
‑
聚赖氨酸(ε
‑
Polylysine，简称ε
‑
PL)是天然的生物防腐剂，一般有25～35个L
‑
赖氨酸残基的ε
‑
氨基和α
‑
羧基相连而成，有着水溶性好、pH、热稳定性强、抑菌图谱广、可生物降解等优势，除了在食品领域的应用，在材料、生物医药等领域也有广泛的应用前景。
[0003]从第一株产ε
‑
PL菌株的发现至今，ε
‑
PL生产菌株的选育仍有较大的提升空间，目前菌株的选育多从诱变育种和基因工程育种两方面开展。关于利用基因工程的手段强化多个基因表达量构建工程菌株提高ε
‑
PL的产量的研究相对较少，尤其是未见通过过表达多个DAP途径中关键酶基因的相关报道。
[0004]通过检索，发现如下几篇与本专利技术专利申请相关的公开文献：
[0005]1.一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373 B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD
‑
4，它是将来源于S.albulus PD
‑/>1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，具有比白色链霉菌S.albulus PD
‑
1(CCTCCM 2011043)更高的ε
‑
PL合成能力。虽然工程菌的ε
‑
聚赖氨酸合成效率有所提高，但ε
‑
PL合成的代谢途径并未强化，小白链霉菌ε
‑
PL产量仍有提升空间。
[0006]2.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε
‑
聚赖氨酸产量的方法(CN 111471633 A)公布了一株淀粉酶产色链霉菌CATF，它是将淀粉酶产色链霉菌TUST的乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(catF)进行过表达处理，较出发菌株ε
‑
聚赖氨酸生产能力提高27.91％。表明了该基因对ε
‑
聚赖氨酸生产能力提高具有重要作用，但只过量表达了单个基因，ε
‑
PL生产水平仍有提升空间。
[0007]3.WangAixia等使用kasOp*强启动子和噬菌体衣壳蛋白的核糖体结合位点，在链霉菌CICC11022中过表达ε
‑
聚赖氨酸合酶基因pls，协同外源添加柠檬酸钠使ε
‑
聚赖氨酸的效价提高88.2％(Frontiers in Bioengineering andBiotechnology，2020，8.288)。
[0008]4.毛忠贵等在高产菌株S.albulus SS
‑
62和其亲本菌株S.albulus M
‑
Z18之间进行了蛋白质组学分析，结果表明参与ε
‑
聚赖氨酸前体代谢和能量代谢的蛋白质的表达水平以及与转录调控和翻译相关通路中的蛋白质表达水平均被上调，qRT
‑
PCR验证发现基因pls、frr、hrdD表达提高，分别过表达基因pls和frr使ε
‑
聚赖氨酸的效价和单位细胞产率得到了少量提高，但效果并不显著(RSC Advances，2019，9(42)：24092
‑
24104)。
[0009]目前虽然有报道将基因工程技术用于ε
‑
聚赖氨酸生产菌株的改造上，但大部分只局限于代谢通路上单一基因的改造，且部分基因的过表达效果并不理想，因此如何通过过表达多个基因进一步提高ε
‑
聚赖氨酸及其盐酸盐生产水平仍是目前迫切需要解决的关键技术难题。
[0010]通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种多基因过表达链霉菌工程菌株及构建方法与应用。
[0012]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0013]一种高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株，所述菌株是同时过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF和二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA构建得到的，通过构建的过表达链霉菌工程菌株发酵来实现提高ε
‑
聚赖氨酸的发酵水平降低生产成本。
[0014]进一步地，所述二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的基因序列为SEQ ID No.1，所述二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的基因序列为SEQ ID No.3。
[0015]进一步地，所述高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株的底盘菌株为产ε
‑
聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括Streptomyces albulus、Streptomyces diastatochromogenes、Streptomyces griseofuscus、Streptomyces ahygroscopicus。
[0016]较优的，所述高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达Streptomyces diastatochromogenes底盘工程菌株为Streptomyces.diastatochromogenes 6#
‑
7，Streptomyces diastatochromogenes 6#
‑
7的保藏编号为CGMCCNO.22261，保藏日期为2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0017]如上所述的高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步
[0018](1)构建带有重组质粒pIMEP::dapF::lysA的E.coli DH5α阳性转化子，提取阳性转化子中的重组质粒pIMEP::dapF::lysA，然后将提取的重组质粒pIMEP::dapF::lysA转化至大肠杆菌E.coli ET12567/PUZ8002中，获得E.coli ET12567/PUZ8002阳性转化子；
[0019](2)制备链霉菌底盘菌株萌发孢子悬液；
[0020](3)将步骤(1)的E.coli ET12567/PUZ8002阳性转化子和步骤(2)萌发的底盘链霉菌孢子悬液分别等体积混合，通过接合转移，得到高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株。
[0021]进一步地，所述带有重组质粒pIMEP:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株，其特征在于：所述菌株同时过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF和二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA。2.根据权利要求1所述的高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株，其特征在于：所述二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的基因序列为与SEQ ID No.1一致及具有相同功能的基因序列，所述二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的基因序列为与SEQ ID No.3一致及具有相同功能的基因序列。3.根据权利要求1所述高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株，其特征在于：所述高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株的底盘菌株为产ε
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聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括Streptomycesalbulus、Streptomycesdiastatochromogenes、Streptomycesgriseofuscus、Streptomycesahygroscopicus。4.根据权利要求3所述高产ε
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聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株，其特征在于：所述Streptomycesdiastatochromogenes底盘菌株为S.diastatochromogenes6#
‑
7，Streptomyces diastatochromogenes6#
‑
7的保藏编号为CGMCCNO.22261，保藏日期为2021年5月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。5.如权利要求1至3任一项所述的高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建带有重组质粒pIMEP::dapF::lysA的E.coliDH5α阳性转化子，提取阳性转化子中的重组质粒pIMEP::dapF::lysA，然后将提取的重组质粒pIMEP::dapF::lysA转化至大肠杆菌E.coliET12567/PUZ8002中，获得E.coliET12567/PUZ8002阳性转化子；(2)制备链霉菌底盘菌株萌发孢子悬液；(3)将步骤(1)的E.coliET12567/PUZ8002阳性转化子和步骤(2)萌发的底盘链霉菌孢子悬液分别等体积混合，通过接合转移，得到高产ε
‑
聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述构建带有重组质粒pIMEP::dapF::lysA的E.coliDH5α阳性转化子的构建步骤如下：目的基因dapF和ermE*的获得：根据dapF基因设计引物dapF
‑
F/dapF
‑
R，在dapF
‑
R引物的5
’
端核酸序列添加和ermE*基因前端5
’
端互补的15～20bp碱基，形成重叠链；以pIMEP::dapF重组质粒为模板，分别以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为上下游引物，进行PCR反应，扩增出带有重叠链的dapF基因，全长879bp，其基因序列为SEQ ID No.1；根据ermE*基因设计引物ermE
‑
F/ermE
‑
R，在ermE
‑
F引物的5
’
端核酸序列添加和dapF基因末端5
’
端互补的15～20bp碱基，形成重叠链；以pIMEP::dapF重组质粒为模板，分别以SEQ ID No.8和SEQ ID No.9为上下游引物，进行PCR反应，扩增出带有重叠链的ermE*基因，全长216bp，其基因序列为SEQ ID No.2；dapF和ermE*融合基因的获得：根据带有重叠链的dapF基因和带有重叠链的ermE*基因设计引物S
‑
F/S
‑
R，采用单酶切同源重组的策略构建重组载体pIEMP::dapF::lysA；在融合基因两端均加入EcoR
Ⅴ
的酶切位点，其中在dapF基因核苷酸序列的上游5
’
端添加EcoR
Ⅴ
的酶切位点和15～20个与出发载体pIMEP::lysA的EcoR
Ⅴ
酶切位点上游相同核苷酸，形成上游同源臂，在ermE*基因核苷酸序列的下游5
’
端添加EcoR
Ⅴ
的酶切位点和15～20个与出发
载体pIMEP::lysA的EcoR
Ⅴ
酶切位点下游相同核苷酸，形成下游同源臂，分别以SEQ ID No.10和SEQ ID No.11为上下游引物，进行PCR反应，扩增出带有同源臂dapF和ermE*融合基因；其中，各基因和扩增引物序列如下：dapF的序列为SEQ ID No.1；dapF
‑
F：SEQ ID No.4；dapF
‑
R：SEQ ID No.5；ermE*的序列：SEQ ID No.2；ermE
‑
F：SEQ ID No.8；ermE
‑
R：SEQ ID No.9；lysA的序列为SEQ ID No.3；lysA
‑
F：SEQ ID No.6；lysA
‑
R：SEQ ID No.7；S
‑
F：SEQ ID No.10；S
‑
R：SEQ ID No.11；将PCR扩增的带有同源臂的dap...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭之磊，裴泽峰，贾士儒，唐鲲鹏，侯颖，周东浩，许倍铭，朱亚新，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：