一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法，包括RNA检测、建库测序、上机测序、RNA测序数据的质量控制、转录组数据与参考基因组比对、基因表达定量及差异基因分析、差异表达基因功能注释和富集分析。本发明专利技术利用测序技术及通过其相关生物学信息的分析，首次公开了芳姜黄酮对黄曲霉的作用机制，为防治黄曲霉污染提供了新的路径及思路，对黄曲霉污染的防治有重要意义。的防治有重要意义。的防治有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其是涉及一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉(Aspergillus flavus)是广泛分布于自然界的腐生好氧真菌，生长和扩散能力极强。黄曲霉可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一组化学结构类似于二呋喃香豆素的衍生化合物。目前已发现的黄曲霉毒素及其衍生物约有20种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，前四种由霉菌污染后直接产生，并存在于植物性食物和饲料中，后两种则是哺乳动物食用了黄曲霉毒素污染的饲料所产生的耐热性羟化代谢产物，其中B1的危害最大，具有显著的导致癌变、畸形、诱导突变和造成免疫力抑制等作用，同时摄入或吸入大量该毒素可引起人和动物肝功能损伤等。黄曲霉毒素通常在全世界温暖的气候中感染粮食作物，包括玉米、花生、树坚果、椰干、香料、棉籽等。目前全球每年有25％农作物被霉菌毒素污染，我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重，结果导致黄曲霉毒素通过食物链危害人类健康。
[0003]防止黄曲霉毒素污染的方法有黄曲霉的防治和对黄曲霉毒素的脱毒。黄曲霉毒素脱毒的方法有机械分离法、密度分离法、热力灭活法、微波照射脱毒法、溶剂萃取去毒法、黏合剂和吸附剂法、化学去毒方法和生物去毒方法等，此类方法均是在黄曲霉毒素产生后进行处理的，可能引入新的食品安全问题或防控成本过高。近年来，有许多研究报道了防控黄曲霉的方法。
[0004]芳姜黄酮是姜科植物根部挥发油的主要成分之一，其中在中药姜黄根块中的含量最高，是姜黄油或姜黄挥发油具有特殊气味的其中一个化合物。芳姜黄酮具有抗不同肿瘤细胞、抑制黑色素原形成、抗真菌、抗生育、抗氧化等功效(Ji,M.；Choi,J.；Lee,J.；Lee,Y.Int.J.Mol.Med.2004,14(2),253
‑
256.)。芳姜黄酮可以通过简单的三步法进行合成，合成原料低廉，操作简单。芳姜黄酮的结构式如下式所示。
[0005][0006]目前，尚未见芳姜黄酮抑制黄曲霉的作用机制的研究。

技术实现思路

[0007]为了了解芳姜黄酮对黄曲霉的作用机制，利用测序技术确定各类基因变化，为黄曲霉的污染防治提供重要的指导和依据，本专利技术的目的是提供一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：
[0009]一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法，包括下列步骤：
[0010]S1、RNA检测：取经芳姜黄酮处理的黄曲霉菌丝为测试组样品，未经芳姜黄酮处理的黄曲霉菌丝为对照组样品，进行RNA检测；
[0011]S2、建库测序；
[0012]S3、上机测序：将单链环状DNA分子通过滚环复制形成DNA纳米球，将得到的DNA纳米球加到芯片上的网状小孔内进行测序；
[0013]S4、RNA测序数据的质量控制；
[0014]S4、转录组数据与参考基因组比对；
[0015]S5、基因表达定量及差异基因分析：对样品中的Mapped Reads的数目和转录本长度进行计算处理，用于不同样本间及组间的横向比较，以及进行样本组之间的差异表达基因分析；
[0016]S6、差异表达基因功能注释和富集分析。
[0017]在一些实施方案中，所述芳姜黄酮的来源于以下制备路线：
[0018][0019]在一些实施方案中，所述黄曲霉菌培养使用PDA培养基。
[0020]本专利技术的具体实施例中，所述黄曲霉菌在28℃下培养7天。
[0021]PDA培养基，是指马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
[0022]在一些实施方案中，将所述培养后的黄曲霉菌制备成黄曲霉菌孢子悬液。
[0023]本专利技术的具体实施例中，黄曲霉菌孢子悬液为1
×
106CFU/mL。
[0024]在一些实施方案中，所述建库测序的方法为：打开消化的总RNA样品二级结构，将mRNA片段化处理，配置合成反应PCR分别合成一链cDNA、二链cDNA，修复好末端、连接好接头后进行PCR扩增，将PCR产物变性为单链后配置环化反应体系反应得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子，得到最终文库。
[0025]在一些实施方案中，步骤S1所述RNA检测包括检测样本浓度、RIN/RQN值、28S/18S。
[0026]在一些实施方案中，步骤S2所述建库测序包括文库的构建和mRNA的纯化。
[0027]本专利技术的具体实施例中，所述mRNA的纯化使用oligo
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dT磁珠。
[0028]在一些实施方案中，步骤S3中将得到的DNA纳米球采用高密度DNA纳米芯片技术加到芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术进行测序。
[0029]在一些实施方案中，步骤S4中，使用Fastp软件对数据进行质量控制，过滤原始数据、检查测序错误率和检查GC含量分布。
[0030]本专利技术的具体实施例中，步骤S5中使用HISAT2将clean reads与参考基因组的序列比较。
[0031]本专利技术的具体实施例中，所述参考基因组版本为JCVI
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AFL1
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v3.0。
[0032]本专利技术的具体实施例中，步骤S6中使用FPKM对样品中的Mapped Reads的数目和转录本长度进行计算处理，FPKM<1视为不表达；使用DESeq2进行样本组之间的差异表达基因分析，筛选差异基因的条件为|log2FC|≥1，FDR<0.05。
[0033]在一些实施方案中，所述FPKM值的计算公式如式下：
[0034][0035]在一些实施方案中，通过所述FPKM计算差异基因表达倍数，即fold change。
[0036]差异基因表达，是指在细胞分化过程中某些奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞的现象。
[0037]在一些实施方案中，步骤S6中还包括：
[0038]通过对假设检验概率进行多重假设检验校正计算FDR；
[0039]通过根据FPKM值计算差异表达倍数。
[0040]本专利技术的有益效果是：
[0041]本专利技术所述的一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法，采用RNA测序技术，及对差异基因分析、差异表达基因功能注释和富集分析、黄曲霉生长和黄曲霉毒素生物合成途径相关基因表达分析，首次公开了芳姜黄酮对黄曲霉作用机制，为防治黄曲霉污染提供了新的路径及思路，对黄曲霉污染的防治有重要意义。
[0042]下面缩写具有如下所示的意义：
[0043]PDA培养基表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
[0044]DNB表示DNA纳米球；
[0045]cPAS表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芳姜黄酮对黄曲霉作用机制的研究方法，包括下列步骤：S1、RNA检测：取经芳姜黄酮处理的黄曲霉菌丝为测试组样品，未经芳姜黄酮处理的黄曲霉菌丝为对照组样品，进行RNA检测；S2、建库测序；S3、上机测序：将单链环状DNA分子通过滚环复制形成DNA纳米球，将得到的DNA纳米球加到芯片上的网状小孔内进行测序；S4、RNA测序数据的质量控制；S4、转录组数据与参考基因组比对；S5、基因表达定量及差异基因分析：对样品中的Mapped Reads的数目和转录本长度进行计算处理，用于不同样本间及组间的横向比较，以及进行样本组之间的差异表达基因分析；S6、差异表达基因功能注释和富集分析。2.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，步骤S2所述建库测序的方法为：打开消化RNA样品的二级结构，将所述二级结构片段化，使用PCR合成一链和二链cDNA，修复末端、连接接头，进行PCR扩增，将PCR产物变性为单链后，采用环化反应体系反应得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子，得到最终文库。3.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，步骤S1所述RNA检测包括检测样本浓度、RIN/RQN值、28S/18S。4.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，步骤S2所述建库...

【专利技术属性】
技术研发人员：马文博，孙雅楠，李喆宇，辜玲慧，周云浩，李波，郑涛，徐越，
申请(专利权)人：成都大学，
类型：发明
国别省市：