一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别涉及特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)16s rRNA的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

技术介绍

[0002]人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)是一种常见的人类病原体，属于支原体属。它是一种非常小的原核生物，大小约为0.1至0.3微米，其形态多变，不具有细胞壁，因此无法通过普通的光学显微镜观察。人型支原体主要通过接触传播，也可通过空气传播。它们可以感染人体的多种器官，包括肺、泌尿生殖系统、眼结膜等，并可能导致肺炎、尿道炎、前列腺炎等疾病。人型支原体具有较强的感染能力，能在多种宿主体内长期存活。
[0003]目前用于检测人型支原体的方法有1.PCR(聚合酶链反应)方法：PCR是一种用于检测特定DNA序列的技术。这种方法可以检测到人型支原体的DNA，灵敏度和特异性都较高。但由于该方法需要反复升降温，对于设备要求较高，扩增检测时间较长，同时由于DNA较为稳定，在病原体死亡后仍可检出，所以易产生假阳性结果。2.培养方法：通过培养人型支原体，可以观察其生长情况。这种方法需要时间较长，一般需要48
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96小时甚至更久，这对于临床检测的时效性有很大影响。3.抗体抗原检测方法：通过检测患者血清中的抗体或尿液中的抗原，可以了解患者是否曾经感染过人型支原体，这种方法相对简单，但灵敏度和特异性较低。
[0004]实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好、通量相对较高等优势。例如专利文献CN111518926A(以下称文献1)公开一种用于检测产毒人型支原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒，能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。然而，该文献1的检测靶标仍为DNA，其较为稳定，在病原体死亡后仍可检出，所以易产生假阳性结果，并且该文献1的方法依赖于PCR技术，需要反复升降温，对于设备要求较高，扩增检测时间仍较长，同时扩增检测产物为DNA，难以降解，易产生环境污染造成假阳性的情况。
[0005]为了快速检测人型支原体，同时降低对荧光定量PCR仪器的要求，专利文献CN111304346A(以下称文献2)公开一种使用环介导等温扩增检测方法，整个检测过程在1h内即可完成，MH的最低检测限为1000拷贝/μL。专利文献CN114410753A(以下称文献3)同样公开一种使用环介导等温扩增方法检测支原体的方法，能够50min得到检测结果，灵敏度达到0.01ng/μl。然而上述文献2和文献3公开的方法的核酸扩增靶标和扩增产物仍均为DNA，仍存在易产生假阳性结果的问题，而且两者的检测灵敏度均较低。
[0006]专利文献CN104342487A(以下称文献4)公开的支原体核酸恒温扩增方法以支原体RNA为扩增靶标，且扩增产物为RNA，易降解，能够避免产生假阳性结果的问题，并且可快速获得检测结果。然而该文献4公开的是针对生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP的核酸恒温扩增引物和靶标检测探针，其并不能用来检测人型支原体，如图1所示，示例性示出了上述文献4公开的针对MG的引物和探针组合分别针对MG和MH的检测结果，可见其只能检测MG，而不能检测MH。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
[0008](1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；
[0009](2)检测液a：其包含第二引物，其与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
[0010](3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
[0011](4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
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MLV反转录酶；
[0012]其中：
[0013]所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0014]所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0015]所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0016]所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
[0017]在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX和Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL。
[0018]在一些实施方式中，所述固相支持物为磁性颗粒。
[0019]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0020](5)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
[0021](6)矿物油；和/或
[0022](7)阳性对照：含有人型支原体核酸的体系；和/或
[0023](8)阴性对照：不含有人型支原体核酸的体系。
[0024]在一些实施方式中，所述洗涤液的组分包括：5～50mM HEPES、50～500mM NaCl、0.5～1.5％ SDS、1
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10mM EDTA。
[0025]在一些实施方式中，所述阳性对照为体外转录人型支原体16s rRNA的稀释物。
[0026]在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250～800mM HEPES，4～10％ LLS，1～50μΜ所述的捕获探针，50～500mg/L磁珠，25～150pmol/mL所述的第一引物。
[0027]在一些实施方式中，所述检测液a的组分包括：10
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50mM Tris，5
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40mM KCl，10
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40mM MgCl2，1
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20mM NTP，0.1
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10mM dNTPs，1
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10％ PVP40，250～750pmol/mL所述的第二引物。
[0028]在一些实施方式中，所述检测液b的组分包括：10
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50mM Tris，5
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40mM KCl，10
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40mM MgCl2，1
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20mM NTP，0.1
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10mM dNTPs，1
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10％ PVP40，143～857pmol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；(2)检测液a：其包含第二引物，其与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
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MLV反转录酶；其中：所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX和Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL；和/或所述固相支持物为磁性颗粒。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或(6)矿物油；和/或(7)阳性对照：含有人型支原体核酸的体系；和/或(8)阴性对照：不含有人型支原体核酸的体系。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的组分包括：5～50mM HEPES、50～500mM NaCl、0.5～1.5％SDS、1
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10mM EDTA；和/或所述阳性对照为体外转录人型支原体16s rRNA的稀释物。5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液的组分包括：250～800mM HEPES，4～10％LLS，1～50μΜ所述的捕获探针，50～500mg/L磁珠，25～150pmol/mL所述的第一引物；所述检测液a的组分包括：10
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50mM Tris，5
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40mM KCl，10
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40mM MgCl2，1
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20mM NTP，0.1
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10mM dNTPs，1
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10％PVP40，250～750pmol/mL所述的第二引物；所述检测液b的组分包括：10
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50mM Tris，5
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40mM KCl，10
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40mM MgCl2，1
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20mM NTP，0.1
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10mM dNTPs，1
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10％PVP40，143～857pmol/mL所述的第一引物，143～857pmol/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，陈艺升，崔振玲，冉鹏展，马煜文，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：