用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的制造技术

本发明专利技术公开了用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的

【技术实现步骤摘要】
用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的PCR引物及方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的
PCR
引物，还涉及检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的方法
。

技术介绍

[0002]羊肺炎是一种临床上常见的疾病，患病羊的主要临床症状包括精神沉郁
、
食欲不振
、
体温升高
、
咳嗽
、
呼吸困难以及呼吸道分泌物增加等
。
研究表明，多杀性巴氏杆菌
、
羊肺炎支原体
、
溶血性曼氏杆菌
、
肺炎链球菌等是引起羊肺炎的主要病原菌
。
其中，羊支原体山羊肺炎亚种
(Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp)
可引起羊传染性胸膜肺炎，该病是一种典型的高发病率
、
高死亡率
、
高传染性的羊呼吸道传染病
。
其临床特征为严重的纤维素性胸膜肺炎，一般潜伏期2～
28
天，平均约
10
天，发病率可达到
100
％，死亡率达
60
～
80
％
。
多杀性巴氏杆菌是存在于羊上呼吸道的条件致病菌，可在长途运输
、
营养不良
、
过度拥挤以及其他支原体或病毒感染等条件作用下，迅速增殖而引起羊肺炎的发生
。
研究表明，羊支原体
、
山羊肺炎亚种感染后可继发多杀性巴氏杆菌感染或发生二者混合感染
。
由于上述两种病原引起的呼吸道症状相似，在临床诊断中，很难通过临床症状和病理特征鉴别诊断这两种疾病的混合感染
。
而传统的鉴别诊断方法，即病原分离和血清学诊断，由于敏感性和特异性不高，难以满足快速鉴别诊断的需要，尤其是
Mccp
在体外培养的困难性，为实现其快速诊断带来了阻碍
。
因此，建立一种可以同时快速
、
准确检测羊肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的方法具有重要的应用价值
。
[0003]核酸免疫层析技术是应用
PCR
扩增技术结合免疫层析技术来检测病原基因
。
特异性的抗原或抗体固定在
NC
膜上形成检测线和质控线，胶体金标记的抗体吸附在结合垫上；待测样本提取核酸后，通过
PCR
扩增在核酸产物两端标记上不同抗原，然后取
PCR
产物进行侧向层析，通过毛细作用向前移动，当待测样本中含有待测基因时，产物可先后与胶体金上标记的抗体和
T
线上的抗体特异性结合，从而形成肉眼可观察的显色结果，冗余的胶体金标记的抗体结合物被
C
线上的二抗捕获固定可显色
。
该方法在核酸检测领域有一定程度上的应用，但是由于取出产物进行层析的过程很容易形成气溶胶污染造成假阳性结果，限制了其广泛应用
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的
PCR
引物，实现羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的快速
、
高效检测
。
[0005]本专利技术的另一目的是提供用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的方法
。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是，用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的
PCR
引物，该
PCR
引物序列如下：
[0007]MCCP
‑
ARCD
‑
F
：
GCACACATTCCATACCCAAC
，同时5’
端标记地高辛；
[0008]MCCP
‑
ARCD
‑
R
：
ATCGCAAGCACCAGCC
，同时5’
端标记荧光素；
[0009]KMT
‑
S1
‑
F
：
TGCTGCTCTATCCGCTATTTACC
，同时5’
端标记地高辛；
[0010]KMT
‑
S1
‑
R
：
AAGACTACCGACAAGCCCACTC
，同时5’
端标记荧光素
。
[0011]本专利技术所采用的另一技术方案是，用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的方法，具体按照以下步骤实施：
[0012]步骤1，提取纯化羊呼吸道疾病的病原菌核酸样本；
[0013]步骤2，以纯化的核酸样本为模板，用
PCR
引物进行微流控芯片
PCR
扩增反应，获得扩增产物；
[0014]步骤3，使用胶体金试纸条，得出诊断结果；若为双线，则为阳性诊断结果；若为单线，则为阴性诊断结果；若为无线，则需重新检测
。
[0015]本专利技术的特点还在于，
[0016]步骤1中，采集病羊的鼻拭子样本
、
咽拭子样本
、
下呼吸道气管吸取液或肺泡灌洗液样本
、
血液样本
、
病死羊组织样本中的任意一种样本，通过磁珠法进行样本的核酸提取；
[0017]具体为：首先在
1.5mL
无核酸酶离心管中加入
200
μ
L
裂解液
、20
μ
L
消化液，加入
200
μ
L
样本，振荡混匀，置于
65℃
，孵育
10
分钟；冷却至室温后，加入
200
μ
L
异丙醇，充分混匀；再加入
20
μ
L
磁珠复合液，振荡混匀
3min
；将离心管置于磁力架上放置
20s
至磁珠完全吸附，开盖，用移液器吸尽管内液体；加入
500
μ
L
洗涤液
A
，将离心管从磁力架上取下，中速振荡
2min
，确保磁珠完全分散；再将离心管置于磁力架上放置
20s
至磁珠完全吸附，开盖，用移液器吸尽管内液体；加入
500
μ
L
洗涤液
B
，将离心管从磁力架上取下，中速振荡
2min
，确保磁珠完全分散；再将离心管置于磁力架上放置
20s
至磁珠完全吸附，开盖，用移液器吸尽管内液体；将离心管从磁力架上取下，开盖，干燥3‑
5min
，至无明显乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的
PCR
引物，其特征在于，该
PCR
引物序列如下：
MCCP
‑
ARCD
‑
F
：
GCACACATTCCATACCCAAC
，同时5’
端标记地高辛；
MCCP
‑
ARCD
‑
R
：
ATCGCAAGCACCAGCC
，同时5’
端标记荧光素；
KMT
‑
S1
‑
F
：
TGCTGCTCTATCCGCTATTTACC
，同时5’
端标记地高辛；
KMT
‑
S1
‑
R
：
AAGACTACCGACAAGCCCACTC
，同时5’
端标记荧光素
。2.
用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的方法，采用如权利要求1中的
PCR
引物，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，提取纯化羊呼吸道疾病的病原菌核酸样本；步骤2，以纯化的核酸样本为模板，用
PCR
引物进行微流控芯片
PCR
扩增反应，获得扩增产物；步骤3，使用胶体金试纸条，得出诊断结果；若为双线，则为阳性诊断结果；若为单线，则为阴性诊断结果；若为无线，则需重新检测
。3.
根据权利要求2所述的用于检测羊肺炎支原体和羊多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于，所述步骤1中，采集病羊的鼻拭子样本
、
咽拭子样本
、
下呼吸道气管吸取液或肺泡灌洗液样本
、
血液样本
、
病死羊组织样本中的任意一种样本，通过磁珠法进行样本的核酸提取；具体为：首先在
1.5mL
无核酸酶离心管中加入
200
μ
L
裂解液
、20
μ
L
消化液，加入
200
μ
L
样本，振荡混匀，置于
65℃
，孵育
10
分钟；冷却至室温后，加入
200
μ
L
异丙醇，充分混匀；再加入
20
μ
L
磁珠复合液，振荡混匀
3min
；将离心管置于磁力架上放置
20s
至磁珠完全吸附，开盖...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤阳，朱坤，陈巧玲，陈思，章昱，李旭博，高宏岩，满初日嘎，杜丽，陈媛媛，
申请(专利权)人：北京源景泰科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：