用于猪链球菌2型和制造技术

本发明专利技术公开了一种用于猪链球菌2型和

【技术实现步骤摘要】
用于猪链球菌2型和1/2型、1型和14型快速分型的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种用于猪链球菌快速分型的试剂盒及其应用，特别涉及一种基于
CRISPR/Cas12a DNAzyme
可视化的用于猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的试剂盒及其应用
。
本专利技术属于生物

。

技术介绍

[0002]猪链球菌
(Streptococcus suis,SS)
属于链球菌科
、
链球菌属
。
菌体多呈球形，可单在
、
成双或呈短链状，不形成芽孢，无鞭毛，但有荚膜，革兰阳性，兼性厌氧菌
。
根据荚膜多糖
cps
抗原性的不同可分为
35
个血清型
(1
～
34
型，
1/2
型
)。2005
年，血清型
32
和
34
被重新分类为鼠源链球菌
。2013
年，
Tien
等经测序分析表明，血清型
20、22、26
和
33
的参考菌株与猪链球菌其余血清型不符，这四种血清型也从猪链球菌血清型中被删除，目前保留
29
种血清型
。
不同的血清型以及相同血清型不同菌株的致病力均不同，其中血清2型和
>14
型不仅会影响猪只的健康，也会引发人类和其他动物的感染
。
[0003]血清分型是了解疫情流行病学
、
监测特定猪链球菌血清型流行率和指导疫苗开发的重要诊断方法
。
目前血清学分型被广泛认为是分型的金标准，但此方法既昂贵又耗时，只能在选定的参考实验室进行，而且血清学不能轻易区分血清2型和
1/2
型，或血清1型和
14
型，因为它们在凝血试验中发生交叉反应
。
由于血清2型和
1/2
型
、1
和
14
型在
cps
位点基因含量相似，仅在
cpsK
基因
483
处存在保守的单核苷酸差异，传统的
PCR
分型方法无法将其区分开
。
目前一系列
PCR
衍生方法，如高分辨率熔化试验
、
限制性片段长度多态性
(PCR
‑
RFLP)
和错配扩增突变测定
(MAMA
‑
PCR)
已被用于区分血清型
2、1/2、1
和
14。
然而，这些检测方法较为复杂，需要多个步骤或特殊仪器
。
[0004]CRISPR
‑
Cas12a
因其高灵敏性和特异性可进行单核苷酸
(SNP)
水平的检测，且无需特殊仪器设备；重组酶聚合酶扩增
(RPA)
不需要特定的温控设备，
37℃15min
即可对靶标基因实现快速扩增，值得注意的是，当
RPA
与具有侧链切割活性的
CRISPR
‑
Cas12a
结合后
RPA
的敏感性可进一步提高；血红素
/G
‑
四链体
DNA
酶可视化系统代替荧光法，结果肉眼可见，摆脱了蓝光仪和酶标仪的束缚，更适用于临床样品现场检测
。
三者结合为猪链球菌血清2型和
1/2
型
、1
型和
14
型分型提供快速，裸眼可视的诊断方法
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于猪链球菌2型和
1/2
型或者1型和
14
型快速分型的试剂盒及其应用
。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0007]首先，本专利技术提出了一种基于
CRISPR/Cas12a
的用于猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的试剂盒，所述的试剂盒中含有以下组分：
[0008](1)
用于扩增含有猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型
cpsK 483
位点序列的
RPA
引物，
所述的引物序列如下：
[0009]RPA
‑
F
：
GGCGGATGGTCATCGCTTTGTGTTTGCCTG
[0010]RPA
‑
R
：
TATTTTCTCGGTCAACATAATAGTACAAGCAC
[0011](2)crRNA
；
[0012]以血清1型和
1/2
型位点
483
→
T
突变为模板设计的
crRNA
的序列为
CCUGUAAUAAACUCUAUA
；以血清1型和
1/2
型位点
483
→
C
突变为模板设计的
crRNA
的序列为
CCUGCAAUAAACUCUAUA
；
[0013](3)Cas12a
；以及
[0014](4)ssDNA
荧光报告因子
。
[0015]其中，优选的，所述的
ssDNA
探针的序列为5’‑
FAM
‑
TTATT
‑
TAMRA
‑3’
。
[0016]进一步的，本专利技术提出了所述的试剂盒在制备猪链球菌2型和
1/2
型或1型和
14
型快速分型的试剂中的应用
。
[0017]更进一步的，本专利技术还提出了一种使用所述的试剂盒进行猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的方法，所述的方法不包含疾病的诊断和治疗方法，所述的方法包括以下步骤：
[0018](1)
分别以血清2型和
14
型或者1型和
1/2
型基因组为模板，使用
RPA
引物快速扩增出目的片段；
[0019](2)
扩增完成后取
2ul
产物加入
CRISPR
检测体系中，
15min
后置于蓝光下观测荧光发光情况，并置于多功能酶标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于
CRISPR/Cas12a
的用于猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有以下组分：
(1)
用于扩增含有猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型
cpsK483
位点序列的
RPA
引物，所述的引物序列如下：
RPA
‑
F
：
GGCGGATGGTCATCGCTTTGTGTTTGCCTGRPA
‑
R
：
TATTTTCTCGGTCAACATAATAGTACAAGCAC(2)crRNA
；以血清1型和
1/2
型位点
483
→
T
突变为模板设计的
crRNA
的序列为
CCUGUAAUAAACUCUAUA
；以血清1型和
1/2
型位点
483
→
C
突变为模板设计的
crRNA
的序列为
CCUGCAAUAAACUCUAUA
；
(3)Cas12a
；以及
(4)ssDNA
荧光报告因子
。2.
如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的
ssDNA
探针的序列为5’‑
FAM
‑
TTATT
‑
TAMRA
‑3’
。3.
权利要求1或2所述的试剂盒在制备猪链球菌2型和
1/2
型或1型和
14
型快速分型的试剂中的应用
。4.
一种使用权利要求1或2所述的试剂盒进行猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的方法，所述的方法不包含疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)
分别以血清2型和
14
型或者1型和
1/2
型基因组为模板，使用
RPA
引物快速扩增出目的片段；
(2)
扩增完成后取
2ul
产物加入
CRISPR
检测体系中，
15min
后置于蓝光下观测荧光发光情况，并置于多功能酶标仪收集终点处荧光信号值，
CRISPR
反应体系如下：
ddH2O 13ul
，
10
×
NEB buffer 2ul
，
Cas12a 1ul
，
crRNA 1ul
，
ssDNA
荧光报告因子
1ul
，
RPA
扩增产物
2ul。5.
基于
CRISPR/Cas12a DNAzyme
可视化的用于猪链球菌2型和
1/2
型
、1
型和
14
型快速分型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有以下组分：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：cpsK，四八三，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：