一种带有寡核苷酸的编码微球及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种带有寡核苷酸的编码微球及其应用，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的带有寡核苷酸的编码微球上连接有用于扩增靶标的上下游引物，以及用于捕获靶标的特异性捕获探针和/或用于检测靶标的检测探针，这种编码微球的组合能够在同一检测体系中同时对多个靶标进行多重定性检测和绝对定量检测，并具有检测成本低和灵敏度高的特点，能够满足临床检测需求。满足临床检测需求。满足临床检测需求。

【技术实现步骤摘要】
一种带有寡核苷酸的编码微球及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种带有寡核苷酸的编码微球及其应用。

技术介绍

[0002]在核酸检测
，新型数字PCR检测方法虽然具有定量准确的优点，但是受制于仪器荧光通道及定量范围窄的限制，在进行多重定量检测时，会受到其使用的仪器的荧光通道数量(一般为4
‑
6个)的限制，仅能在一个体系内同时最多对4
‑
6个靶标进行检测区分，在一些需要对超过这个数量的靶标进行定量检测时，则需要通过多个体系检测累加完成。比如在血流感染病原体检测中，需要检测的病原体超过20种，这就需要通过4
‑
6个体系进行检测，不但增加了检测成本，同时也需要更长的检测时间和更多的操作程序，降低了检测效率。因此，亟需一种通量高、节省时间的方法来满足临床上更多靶标检测的需求。
[0003]编码微球检测技术是以一种或多种粒径并且携带不同浓度荧光信号的微球为固相载体，可同时对样本中多种检测物(靶标)进行检测分析的一种新型的高通量检测技术，具有通量高(在单个检测体系中可实现多达100种以上不同靶标的检测)、线性范围广、准确性高、重复性好等诸多优点。目前多重编码微球检测技术在临床诊断和医学研究领域具有广泛的应用，如在肿瘤相关疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、炎症感染、传染性疾病等检测中，为疾病的鉴别诊断、治疗监测和病情评估等提供了较高的临床价值。例如专利文献CN105002285A(以下称文献1)公开一种微小RNA的液态芯片恒温检测方法，其将上游和/或下游引物固定在编码微球的表面，并在其表面固定的引物缺口剂识别序列两侧标记具有荧光共振能量转移作用的荧光报告分子和淬灭分子，最终能够在恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增和绝对定量。然而该文献1必须在其检测体系中加入缺口剂(指可识别完全或部分双链核酸分子的NARS序列，并且只在NARS序列双链区域的缺口位点切割一条核酸分子链的内切酶)，并且需要将上下游引物设计成含有由缺口剂识别和可切割的缺口剂识别序列，这增加了检测成本；另外，该文献1的检测方法只能检测miRNA靶分子或具有3
’‑
OH的其它小片段核酸分子，因此其广谱检测性较差。专利文献CN108660191A(以下称文献2)公开一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法，其包括样本核酸提取、引物设计、杂交捕获、微滴生成、扩增反应以及扫描检测等步骤，能够结合杂交技术的多重基因检测优势和数字PCR的高灵敏度定量检测优势。然而，以上文献2在其体系中使用的是非特异性荧光染料，会导致其检测的通量较低，而且在微滴生成过程中利用微滴生成器使得每个微滴中最多含有一个编码微球的过程极难实现，且操作繁琐，通常每一个微滴中会包裹数量不同的多个编码微球，这就导致对靶标的定量检测结果不准确，且检测效率较低。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种编码微球，其上连接有用于扩增靶标的上下游引物，其中所述编码微球上还连接有用于捕获靶标的特异
性捕获探针和/或用于检测靶标的检测探针。
[0005]在一些实施方式中，所述编码微球包括但不限于荧光编码微球、量子点编码微球、磁性荧光编码微球、上转换发光编码微球和拉曼光谱编码微球。
[0006]在一些实施方式中，所述检测探针包括TaqMan探针、分子信标、分子火炬和蝎子探针。
[0007]在一些实施方式中，所述特异性捕获探针和检测探针通过以下方式中任一种或多种连接在所述编码微球上：
[0008](1)以共价键和非共份键的结合方式连接；
[0009](2)通过物理吸附和/或化学耦联方式连接；
[0010](3)具有胺基的烷基或者芳基化合物作为连接肽连接；
[0011](4)具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽连接；和
[0012](5)通过手臂分子连接。
[0013]本专利技术另一方面提供一种编码微球的组合，其用于在同一体系中检测多个靶标，其中所述编码微球的组合包括分别检测所述多个靶标的多种上述的编码微球，其中每一种编码微球具有可识别的唯一性标志。
[0014]在一些实施方式中，所述体系包括但不限于PCR、RT
‑
PCR、TMA、LAMP、RPA、CPA和SAT扩增检测体系。
[0015]本专利技术再一方面提供一种同时检测HPV的9种基因型的多重检测试剂盒，其中所述HPV的9种基因型包括HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66，其中所述多重检测试剂盒包括分别检测所述HPV的9种基因型的9种上述的编码微球，其中每一种编码微球具有可识别的唯一性标志，且在每一种编码微球上均连接有用于扩增对应HPV基因型的上下游引物，以及用于捕获对应HPV基因型的特异性捕获探针和/或用于检测对应HPV基因型的检测探针。
[0016]在一些实施方式中，分别用于捕获基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17
‑
25所示。
[0017]在一些实施方式中，分别用于扩增基因型基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26
‑
34所示。
[0018]在一些实施方式中，分别用于扩增基因型基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:35
‑
43所示。
[0019]在一些实施方式中，分别用于检测基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:44
‑
52所示。
[0020]在一些实施方式中，所述多重检测试剂盒还包括：
[0021]核酸提取液：其包含250
‑
800mM HEPES和4
‑
10％ LLS，且所述9种编码微球位于该核酸提取液中；
[0022]扩增检测液：其包含10
‑
50mM Tris、5
‑
40mM KCl、10
‑
40mM MgCl2、1
‑
20mM NTP、
0.1
‑
10mM dNTPs、1
‑
10％ PVP40；和
[0023]SAT酶液：其包含16000
‑
160000U/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码微球，其上连接有用于扩增靶标的上下游引物，其特征在于，所述编码微球上还连接有用于捕获靶标的特异性捕获探针和/或用于检测靶标的检测探针。2.根据权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述编码微球包括但不限于荧光编码微球、量子点编码微球、磁性荧光编码微球、上转换发光编码微球和拉曼光谱编码微球。3.根据权利要求1或2所述的编码微球，其特征在于，所述检测探针包括TaqMan探针、分子信标、分子火炬和蝎子探针。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的编码微球，其特征在于，所述特异性捕获探针和检测探针通过以下方式中任一种或多种连接在所述编码微球上：(1)以共价键和非共份键的结合方式连接；(2)通过物理吸附和/或化学耦联方式连接；(3)具有胺基的烷基或者芳基化合物作为连接肽连接；(4)具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽连接；和(5)通过手臂分子连接。5.一种编码微球的组合，其用于在同一体系中检测多个靶标，其特征在于，所述编码微球的组合包括分别检测所述多个靶标的多种权利要求1
‑
4中任一项所述的编码微球，其中每一种编码微球具有可识别的唯一性标志。6.根据权利要求5所述的编码微球的组合，其特征在于，所述体系包括但不限于PCR、RT
‑
PCR、TMA、LAMP、RPA、CPA和SAT扩增检测体系。7.一种同时检测HPV的9种基因型的多重检测试剂盒，其中所述HPV的9种基因型包括HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66，其特征在于，所述多重检测试剂盒包括分别检测所述HPV的9种基因型的9种权利要求1
‑
4中任一项所述的编码微球，其中每一种编码微球具有可识别的唯一性标志，且在每一种编码微球上均连接有用于扩增对应HPV基因型的上下游引物，以及用于捕获对应HPV基因型的特异性捕获探针和/或用于检测对应HPV基因型的检测探针。8.根据权利要求7所述的多重检测试剂盒，其特征在于，分别用于捕获基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17
‑
25所示；分别用于扩增基因型基因型HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 52、HPV 58和HPV 66的上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26
‑
34所示；分别用于扩增基因型基因型HPV 16、HPV 18、HPV 3...

【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，侯伟，冉鹏展，张适麒，蒋彩英，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：