一种多年冻土微生物DNA的提取和检测方法技术

本发明专利技术提供了本发明专利技术提供了一种多年冻土层土壤微生物样本的提取方法，包括以下步骤：获取多年冻土微生物样本；采用CTAB法获取多年冻土微生物DNA样本的获取；提取多年冻土微生物DNA；其中，所述多年冻土微生物DNA样本的提取包括将S2中所述多年冻土微生物DNA样本进行MDA扩增；经所述MDA扩增后的DNA可用于宏基因组测序。利用本发明专利技术的方案能有效提取到青藏高原多年冻土微生物总DNA，尤其是覆盖在活动层以下多年冻土层的低生物量微生物DNA，并利于对其进行检测，为青藏高原多年冻土微生物宏基因组测序研究提供技术支持。因组测序研究提供技术支持。因组测序研究提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种多年冻土微生物DNA的提取和检测方法
[0001]本申请是申请日为2022年7月7日，申请号为CN202210792689.0，专利技术名称为多年冻土微生物DNA样本获取及DNA的提取和检测方法的专利技术专利的分案申请。


[0002]本专利技术涉及冻土微生物核酸提取
，具体地说是一种多年冻土微生物DNA的提取和检测方法。

技术介绍

[0003]多年冻土长期处于0℃以下低温环境，被认为是一个储存古老活性细胞的巨大“仓库”，是微生物生存的独特生境，也是探究微生物在零下温度中存活并生长的理想场所。近年来，从多年冻土环境中分离出具有再生能力的巨型DNA病毒及细菌的报道，表明微生物(细菌、古菌、真菌和病毒等)能够以某种方式(如停止营养生长的休眠状态)长期存活于多年冻土环境中。尽管它们的代谢速率非常低，但绝非是以休眠状态存在的“幸存者”。事实上，多年冻土微生物在碳、氮、硫等地球化学过程中也发挥重要作用。但是，随着气候的变化，多年冻土融化趋势越来越严重，使得原来储存在冻土中的大量微生物分解。然而，对多年冻土融化释放碳的准确评估仍然是个很大的挑战，其中一部分原因是我们对微生物群落响应及多年冻土层内的微生物的代谢机制缺乏清晰的认识，尤其是其中大量未知的微生物种群。
[0004]据统计，中国多年冻土微生物细胞数量最高达10
10
cells/g，且不同研究区域的差异较大。相关研究所得可培养微生物数量仅占冻土微生物细胞总数的很小一部分。例如，青藏高原腹地北麓河流域多年冻土可培养微生物数量为102～106CFU/g，而细胞总数则介于107～109cells/g。造成该差异的原因有微生物自身不可培养的特性(如“侏儒”细胞)、不适当的样品预处理(如反复冻融)，以及特殊的微生物类群需要特别的培养状况等。同时，多年冻土微生物数量受到各种非生物因素的影响。例如，随着多年冻土深度或年代的增加，从多年冻土中恢复活细胞的容易程度变小，微生物数量呈现下降的趋势。显然，对于多年冻土微生物基因的研究已经刻不容缓。
[0005]但是，近些年来，多年冻土微生物多样性研究主要集中在南北极，尤其是西伯利亚和加拿大北部多年冻土区的研究最为丰富。多年冻土蕴藏丰富多样的微生物类群，包括细菌、古菌、真菌、蓝细菌、病毒等，其中包括大量未知的稀有或特有微生物。特别是病毒，人们对其物种多样性的认知至今依然十分有限。多年冻土中生存的原核微生物为病毒提供了宿主。病毒不仅影响着原核微生物群落的组成，而且通过裂解宿主细胞和降低原核生物群落的生长率，进一步影响多年冻土中的物质循环。同时，值得注意的是，多年冻土病原微生物有可能通过复苏感染、基因传播等方式导致生物安全风险。人类面对史前病毒并没有很好的防御手段，而群居的生活习性也会导致病毒的扩散速度极快，对人类和动植物造成影响，威胁生物及生态安全，因此对多年冻土中病毒DNA的研究具有重要意义。
[0006]青藏高原是全球中低纬度、高海拔地区最大的多年冻土分布区，其多年冻土发育
特点明显，表现为活动层较厚、浅层冻融现象频繁，多年冻土层埋藏深、温度高、含冰量低、稳定性差等的特点。迄今为止，高原多年冻土微生物的研究极为缺乏，尤其是病毒相关研究基本为“盲盒”。而核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中发挥非常重要的作用。专家预测，未来青藏高原小于10米厚度的多年冻土可能会消失，而多年冻土中的古病毒即会释放，但是目前对于多年冻土中的病毒DNA的研究几乎为空白。同时，以核酸测序为基础的宏基因组测序技术成为微生物生态学研究最主要的方法学之一，是当前揭示微生物(细菌、真菌、古菌和病毒等)群落结构组成、多样性和功能特性等最佳的技术手段。核酸的提取及核酸样品的质量将直接关系到深入分析的成败与研究结果的可靠性。“Large
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scale evidence for microbial response and associated carbon release after permafrost thaw”，Primary Research Articles，2020年12月，Yongliang Chen等给出了对青藏高原24个样点的多年冻土的活动层(采样深度为1.5～3.5m)进行大规模取样并运用宏基因组技术(功能基因芯片和IlluminaMiSeq测序)来探索多年冻土融化(对多年冻土样品在5℃下培养11天)对微生物分类和功能群落的影响，具体地采用高通量测序来检测细菌和真菌的分类多样性，旨在获取相同时期、活性高的微生物作为研究对象构建微生物分解过程中冻土碳和气候反馈的方向和强度之间的关系。然而，多年冻土层却难以通过高通量测序获取DNA序列，主要原因在于：一方面覆盖在活动层以下的更深的多年冻土层样本难以获取，另一方面微生物生物量和核酸量低、难以提取并满足当前高通量测序的基本要求。
[0007]进一步地，随着多年冻土深度的增加，常规方法能获取到的总DNA量迅速下降。相较于350cm以上活动层，350cm以下，尤其是多年冻土层中层(500～600cm)和下层(600～1500cm)的多年冻土层样品中能获取到的DNA总量非常少，特别是深度越大DNA总量会越少，而，能够获取到的总DNA量是是否能够进行下一步文库构建和宏基因组测序分析等的重要基础，这也是现有技术将基因测序工作集中在活动层以上的重要原因。而采用宏基因组测序分析对样本的要求较高，通常需要在0.03μg以上，区别于现有技术中的16S基因测序对DNA的总量在100ng甚至更低即可获得DNA序列。但是，16S基因测序得到的序列注释不到种水平，而宏基因组测序则能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平，通过宏基因组测序对多年冻土微生物进行物种鉴定的层次进行基因分析，为揭示冻土微生物中的微生物(细菌、真菌、古菌和病毒等)群落结构组成、多样性和功能特性等提供数据支持，从而实现为多年冻土层的微生物生态学的研究提供助力，尤其是对古病毒的相关研究具有极大的推动作用。
[0008]为此，本专利技术提出一种青藏高原多年冻土低生物量样本的提取技术，以多年冻土层中的微生物作为研究对象，为多年冻土层的微生物生态学的研究提供助力。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种多年冻土微生物DNA样本获取及DNA的提取和检测方法，选取多年冻土不同深度的微生物作为研究对象，采用改良的CTAB法进行多年冻土层内的微生物进行DNA样本的获取，并通过MDA扩增的方法对总DNA进行提取，采用荧光法进行定量分析，得到足量的DNA量并已经满足后续的宏基因组文库构建和测序。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案。
[0011]本专利技术提供了一种多年冻土层土壤微生物样本的提取方法，包括以下步骤：
[0012]S1.获取多年冻土微生物样本；
[0013]S2.采用CTAB法获取多年冻土微生物DNA样本的获取；
[0014]S3.提取多年冻土微生物DNA；
[0015]其中，S3中，所述多年冻土微本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获取多年冻土微生物样本；S2.采用CTAB法获取多年冻土微生物DNA样本的获取；S3.采用MDA扩增的方法或直接提取多年冻土微生物DNA。2.根据权利要求1所述的多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，S2中，所述CTAB法包括传统的CTAB法或改良的CTAB法；所述传统的CTAB法对所述多年冻土微生物样本提取的DNA总量低于0.03μg；经所述MDA扩增后总DNA量在1μg以上，能够用于后续的宏基因组文库构建和测序；和/或，所述改良的CTAB法对所述多年冻土微生物样本提取的DNA总量在0.1μg以上，经所述MDA扩增后或直接提取后用于宏基因组文库构建和测序。3.根据权利要求2所述的多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述MDA扩增包括将所述DNA样本经纯化后进行样本变性
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MDA扩增
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16S rDNA PCR扩增，获得PCR产物；和/或，所述MDA扩增的MDA扩增体系包括dNTP、DTT、Phi29酶、BSA和超纯水；其中，Phi29酶的添加量为0.8～2μL/45μL。4.根据权利要求3所述的多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述MDA扩增体系中各组分与所述变性产物的体积百分比分别为dNTP∶DTT∶Phi29酶∶BSA∶变性产物＝4∶0.8∶0.8～2∶0～0.2∶5～10；和/或，所述16S rDNA PCR扩增中，采用的引物包括正向引物和反向引物；正向引物(341
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F)的序列包括：5
′‑
CCTACGGGAGGCAGCAG
‑3′
；反向引物(926
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R)的序列包括：5
′‑
CCGTCAATTCCTTTRAGTTT
‑3′
。5.根据权利要求3所述的多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，S2中，所述多年冻土微生物DNA样本使用NucleoSpin胶/PCR产物纯化试剂盒进行纯化；所述样本变性采用PCR扩增仪进行变性得到变性产物。6.根据权利要求2
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5任一项所述的多年冻土微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述改良的CTAB法包括以下步骤：(1)菌体裂解：将S1获取到的所述多年冻土微生物样本研磨后，加入PBS缓冲液经振荡
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈生云，邹远强，徐静阳，施一，吴明辉，
申请(专利权)人：青欧生命科学高等研究院，
类型：发明
国别省市：