同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的核酸提取液、检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于以上这些微生物检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对多种呼吸道病原体的实时、快速检测，并且灵敏度高、特异性好，扩增产物RNA易降解不会引起环境污染，且在检测过程中不会引起样本交叉污染。且在检测过程中不会引起样本交叉污染。

【技术实现步骤摘要】
同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，还涉及同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的专用引物和探针，特别是涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

技术介绍

[0002]呼吸系统感染性疾病是临床上的常见病、多发病。引起呼吸道疾病的病原体种类很多，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类。呼吸道病毒可以通过空气传播，是引起急性呼吸系统感染性疾病的病原体，具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，严重危害人类的健康。常见的呼吸道病毒包括以下几种。
[0003]流行性感冒病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒可自然感染人和多种动物，常突然发生、传播迅速，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒在自然情况下仅感染人，一般呈散发、爆发或小流行；丙型流感病毒常感染儿童，多呈散发、偶发或爆发，但不流行。甲型流感病毒的表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)容易变异，已知HA有16个亚类(H1
‑
H16)，NA有9个亚类(N1
‑
N9)，它们之间的随意组合可形成多种亚型，各亚型之间无交叉免疫力。这种变异特性给流感的诊断和防控造成很大困难。
[0004]呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)属副黏病毒科肺炎属RNA病毒，临床研究表明，呼吸道合胞病毒是引起病毒性肺炎的最常见的病原体，多见于三岁以下的婴幼儿，主要症状有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。
[0005]副流感病毒(Human Parainfluenza viruse，HPIVs)是单链的RNA病毒，常常引起儿童下呼吸道感染，其致病性仅次于RSV。与RSV一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。
[0006]上述多种呼吸道病毒引起的呼吸道感染性疾病具有相似的临床症状和流行特征，严重的可能导致重症肺炎、呼吸衰竭，甚至死亡，早诊断、早治疗、早隔离是防止的根本。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病毒种类，而且病毒的培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，这给呼吸道感染患者及临床医生带来很大困扰。因此本领域迫切需要一种简便、快速、客观的检测多种呼吸道病毒(呼吸道病原体)的方法，从而实现明确病原、及早诊断、合理指导临床用药。
[0007]专利文献CN115323072A(以下称文献1)公开一种同时检测六种呼吸道病原体的组合物、试剂盒和方法，其利用12条特异性引物和6条探针，可快速鉴定六种呼吸道病原菌甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠状病毒，且针对每一种呼吸道病毒，最低检出限为1000copies/mL(阳性检出率为100％)。然而，该文献1公开的方法是基于PCR的基本原理，其在PCR反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间也较长(一般需要2
‑
3小时)，效率较低；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。为了克服PCR方法在检测呼吸道病原体时的缺陷，专利文献CN110964854A(以下称文献2)公开一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物素信号放大)技术的同时检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒，其可在RNA恒温扩增条件下实现对甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体的检测，且结合多生物素信号放大技术实现高灵敏度检测。然而，在该文献2提供的方法中的多生物素信号放大步骤中，需要将RNA恒温扩增产物与特异性探针、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，此过程中仍存在样本交叉污染和实验室环境污染的风险；另外，该文献2采用多生物素信号放大技术，需要设计更多的特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)和放大探针，这增加了检测成本，并且在多生物素信号放大步骤中，需要在50℃条件下继续恒温孵育1小时，这会降低检测效率。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，所述流感病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒，所述试剂盒包括：
[0009](T1)核酸提取液：其包含含有第一特异性捕获探针、第二特异性捕获探针、第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针的固相支持物，其中第一至第四特异性捕获探针分别用于捕获甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的检测序列；
[0010](T2)检测液：其包含第一引物、第二引物、第一靶标检测探针、第三引物、第四引物、第二靶标检测探针、第五引物、第六引物、第三靶标检测探针、第七引物、第八引物和第四靶标检测探针；其中所述第一引物、第二引物和所述第一靶标检测探针配合，用于检测甲型流感病毒的靶标序列；所述第三引物、第四引物和所述第二靶标检测探针配合，用于检测乙型流感病毒的靶标序列；所述第五引物、第六引物和所述第三靶标检测探针配合，用于检测呼吸道合胞病毒的靶标序列；所述第七引物、第八引物和第四靶标检测探针配合，用于检测副流感病毒的靶标序列；在所述第一靶标检测探针、第二的靶标检测探针、第三靶标检测探针和第四靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且四者携带的荧光报告基团不同；
[0011](T3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；
[0012]其中：
[0013]所述第一特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述第二特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，所述第三特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述第四特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
[0014]所述第一引物包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0015]所述第三引物包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，所述流感病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒，其特征在于，包括：(T1)核酸提取液：其包含含有第一特异性捕获探针、第二特异性捕获探针、第三特异性捕获探针和第四特异性捕获探针的固相支持物，其中第一至第四特异性捕获探针分别用于捕获甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的检测序列；(T2)检测液：其包含第一引物、第二引物、第一靶标检测探针、第三引物、第四引物、第二靶标检测探针、第五引物、第六引物、第三靶标检测探针、第七引物、第八引物和第四靶标检测探针；其中所述第一引物、第二引物和所述第一靶标检测探针配合，用于检测甲型流感病毒的靶标序列；所述第三引物、第四引物和所述第二靶标检测探针配合，用于检测乙型流感病毒的靶标序列；所述第五引物、第六引物和所述第三靶标检测探针配合，用于检测呼吸道合胞病毒的靶标序列；所述第七引物、第八引物和第四靶标检测探针配合，用于检测副流感病毒的靶标序列；在所述第一靶标检测探针、第二的靶标检测探针、第三靶标检测探针和第四靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团，且四者携带的荧光报告基团不同；(T3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；其中：所述第一特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述第二特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，所述第三特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述第四特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述第五引物包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述第六引物包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第三靶标检测探针包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；所述第七引物包含如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，所述第八引物包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述第四靶标检测探针包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS；优选含有5
‑
50mM HEPES、50
‑
500mM NaCl、0.5
‑
1.5％SDS、1
‑
10mM EDTA；和/或(M2)矿物油；和/或(M3)阳性对照：含有甲型流感病毒核酸、乙型流感病毒核酸、呼吸道合胞病毒核酸、副流感病毒核酸的体系，可选为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒体外转录RNA的体系；和/或(M4)阴性对照：不含有甲型流感病毒核酸、乙型流感病毒核酸、呼吸道合胞病毒核酸、副流感病毒核酸的体系。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％LLS(十二烷基磺酸锂)、1
‑
50μ
Μ的第一特异性捕获探针、1
‑
50μΜ的第二特异性捕获探针、1
‑
50μΜ的第三特异性捕获探针、1
‑
50μΜ的第四特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠；所述检测液的组分包括：250
‑
750pmol/mL的第一引物、250
‑
750pmol/mL的第二引物、250
‑
750pmol/mL的第三引物、250
‑
750pmol/mL的第四引物、250
‑
750pmol/mL的第五引物、250
‑
750pmol/mL的第六引物、250
‑
750pmol/mL的第七引物、250
‑
750pmol/mL的第八引物、250
‑
750pmol/mL的第一靶标检测探针、250
‑
750pmol/mL的第二靶标检测探针、250
‑
750pmol/mL的第三靶标检测探针、250
‑
750pmol/mL的第四靶标检测探针；所述SAT酶液的组分包括：16000
‑
160000U/mL的M
‑
MLV反转录...

【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，葛俊楠，侯伟，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：