一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括分别特异性扩增并检测新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的引物对和探针；扩增所述N基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；本发明专利技术中所述检测新型冠状病毒的引物探针组合具有很好的特异性与灵敏度。本发明专利技术还提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒便于携带，检测精准性高，使用时操作简单、检测快速、结果准确，适用于临床分子诊断。适用于临床分子诊断。适用于临床分子诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜的RNA病毒，其基因组为线性单股正链，是自然界广泛存在的一大类病毒，是目前已知的RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和其他脊椎动物的多种疾病相关，可引起人和其他脊椎动物的呼吸道、消化道和神经系统的疾病。冠状病毒分为α、β、γ和δ，总共4个属。其中人类冠状病毒(HCoV)有2个属，包括α冠状病毒(HCoV
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229E和HCoV
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NL63)和β冠状病毒(HCoV
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HKU1、HCoV
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OC43、MERS
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CoV和SARS
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CoV)。
[0003]新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，其基因的特征与SARS
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CoV和MERS
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CoV有明显区别。目前研究显示新型冠状病毒的基因与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat
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SL
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CoVZC45)的基因的同源性高达85％以上，人群普遍易感。
[0004]目前新型冠状病毒的感染患者是主要的传染源，无症状感染者也可能成为传染源，经呼吸道飞沫传播和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶，存在经气溶胶传播的可能。由于在粪便及尿液中可分离到新型冠状病毒，因此，应当注意粪便及尿液对环境的污染，避免造成气溶胶传播或接触传播。基于目前的流行病学调查，人感染新型冠状病毒后的潜伏期为1～14天，一般情况下潜伏期为3～7天。感染新型冠状病毒后的临床表现包括发热、干咳和乏力。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力，无肺炎表现。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是，重型、危重型患者的病程中可能仅为中低热，甚至无明显发热。部分儿童及新生儿病例症状不典型，表现为呕吐和腹泻等消化道症状，或者仅表现为精神弱或呼吸急促。因此，通过症状难以确认是否感染了新型冠状病毒。
[0005]目前，临床上的疑似病例需要通过实时荧光RT
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PCR检测新型冠状病毒核酸，疑似病例的新型冠状病毒核酸检测结果呈阳性，表明其感染了新型冠状病毒，疑似病例连续两次的新型冠状病毒核酸检测结果呈阴性(采样时间至少间隔24小时)且发病7天后新型冠状病毒特异性抗体IgM和IgG仍为阴性可排除疑似病例诊断。
[0006]因此，开发一种精确灵敏同时便携的检测新型冠状病毒的试剂盒对新型冠状病毒的检测具有重要意义和应用前景。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用。本专利技术中所述检测新型冠状病毒的引物探针组合具有很好的特异性与
灵敏度。本专利技术还提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒便于携带，检测精准性高，使用时操作简单、检测快速、结果准确，适用于临床分子诊断。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括分别特异性扩增并检测新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的引物对和探针；
[0010]扩增所述N基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；
[0011]所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
[0012]所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0013]SEQ ID No.1：GTAACCAGAATGGAGAACGCAGT。
[0014]SEQ ID No.2：CTTCCTTGCCATGTTGAGTGAGA。
[0015]本专利技术中，所述N基因为核衣壳蛋白(Nucleoprotein)的编码基因，所述ORF1ab基因为编码SARS
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CoV
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2病毒的开放阅读框1ab(Open reading frame1ab)的基因，这两个基因较为保守，变异较小。通过针对N基因和ORF1ab基因设计特异性扩增的引物对及对应的探针，能够避免因基因变异导致的检测问题。本专利技术基于多重RT
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PCR技术，使用所述特异性扩增并检测新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的引物对和探针可以提高检测的精确性。
[0016]优选地，检测所述N基因的探针包括探针P1。
[0017]优选地，所述探针P1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018]SEQ ID No.3：CAACGTCGGCCCCAAGGTTTACC。
[0019]优选地，所述探针P1的5
’
端修饰荧光素，所述探针P1的3
’
端修饰淬灭剂。
[0020]本专利技术中，所述探针P1的荧光素为六氯荧光素(HEX)，淬灭剂为BHQ1。
[0021]优选地，扩增所述ORF1ab基因的引物对包括上游引物FP2和下游引物RP2。
[0022]优选地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0023]优选地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
[0024]SEQ ID No.4：TAGTTTAGCTGCCACAGTACGTC。
[0025]SEQ ID No.5：CAGCAAAAGCACAGAAAGATAATACAGT。
[0026]优选地，检测所述ORF1ab基因的探针包括探针P2。
[0027]优选地，所述探针P2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
[0028]SEQ ID No.6：AATTGGCAGGCACTTCTGTTGCAT。
[0029]优选地，所述探针P2的5
’
端修饰荧光素，所述探针P2的3
’
端修饰淬灭剂。
[0030]本专利技术中，所述探针P2的荧光素为5
‑
羧基荧光素(FAM)，淬灭剂为BHQ1。
[0031]优选地，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测人核糖核酸酶P(RNase P)基因的引物对和探针。
[0032]本专利技术中，所述人核糖核酸酶P基因编码人核糖核酸酶P，人核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白，含有一个单链RNA分子，其长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽。本专利技术中以人核糖核酸酶P基因为内源性内参，所述人核糖核酸酶P基因含量相对丰富、表达稳定，以其为内源性内参较为准确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括分别特异性扩增并检测新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的引物对和探针；扩增所述N基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，检测所述N基因的探针包括探针P1；优选地，所述探针P1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P1的5
’
端修饰荧光素，所述探针P1的3
’
端修饰淬灭剂；优选地，扩增所述ORF1ab基因的引物对包括上游引物FP2和下游引物RP2；优选地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；优选地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；优选地，检测所述ORF1ab基因的探针包括探针P2；优选地，所述探针P2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P2的5
’
端修饰荧光素，所述探针P2的3
’
端修饰淬灭剂。3.根据权利要求1或2所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测人核糖核酸酶P基因的引物对和探针；优选地，扩增所述人核糖核酸酶P基因的引物对包括上游引物FP3和下游引物RP3；优选地，所述上游引物FP3包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；优选地，所述下游引物RP3包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；优选地，检测所述人核糖核酸酶P基因的探针包括探针P3；优选地，所述探针P3包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P3的5
’
端修饰荧光素，所述探针P3的3
’
端修饰淬灭剂。4.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合和反应液；优选地，所述反应液包括PCR缓冲液、酶混合液和水；优选地，所述酶混合液包括Taq酶和逆转录酶；优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李超，张建东，
申请(专利权)人：凡知医疗科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：