一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用，所述检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对和探针；扩增所述非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术针对非洲猪瘟病毒p72基因和猪肌动蛋白基因，设计了针对非洲猪瘟病毒所有基因型的引物探针组合。本发明专利技术还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒具有操作简单、快速、准确等优点，适用于临床分子诊断。适用于临床分子诊断。适用于临床分子诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种大型(200nm)复杂的有囊膜的双链DNA病毒，通常认为其只有一种血清型。但是，基于红细胞吸附抑制试验(HAI)可以将ASFV毒株至少分成8个血清群。基于其p72基因部分片段的遗传演化分析，可将当前毒株分为24个基因型，我国目前流行的毒株属基因II型。
[0003]非洲猪瘟病毒以接触传染为主，可经由厨余食物、节肢动物、动物分泌物、动物排泄物、车辆及人员夹带等途径传播。发病猪的特征为发高热、皮肤呈现紫斑点、全身内脏出血，尤其以淋巴结、肾脏和肠粘膜最明显。病程分为特急性、急性、亚急性与慢性四种。特急性的症状为：发烧、突然死亡，无其他症状。急性的症状为：高烧、食欲尚有、死亡前食欲废绝、呼吸快、精神不良、四肢、耳、皮肤发绀、呕吐、下痢直到死亡，为期7天。亚急性的症状为：发烧3～4星期。慢性：病状不明显，持续数月。目前尚无可供治疗的药物及疫苗。
[0004]CN109781980A公开了一种非洲猪瘟病毒快速检测卡及其应用，所述检测卡的金标垫上吸附有胶体金标记的抗非洲猪瘟病毒p30、p54和p72蛋白的多克隆抗体PoAb I，检测膜上设有羊抗或兔抗小鼠IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A，SPA)印制的质控线C，还设有抗非洲猪瘟病毒p30、p54和p72蛋白的多克隆抗体PoAb II印制的检测线T，所述非洲猪瘟病毒快速检测卡采用双抗体夹心法，检测的特异性强、效率高。
[0005]但是，对于特急性、急性或亚急性ASFV感染病例，PCR是首选的检测技术。此外，由于PCR检测的是病毒的基因组，对于病毒分离鉴定为阴性的、含有无感染性病毒粒子的样品也可完成检测，这也使其成为检测感染低或中等毒力毒株的重要工具。虽然聚合酶链式反应不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。
[0006]因此，开发一种精准性高同时便携的检测所有基因型的非洲猪瘟病毒试剂盒对于ASFV感染病例的检测具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用。本专利技术针对非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因和猪肌动蛋白(β
‑
actin)基因，设计了针对非洲猪瘟病毒(ASFV)所有基因型的引物探针组合，本专利技术所述的检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的所有基因型。本专利技术还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒通过qPCR对非洲猪瘟病毒进行检测，所述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒具有操作简单、快速、准确等优点，适用于临床分子诊断。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，所述检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对和探针；
[0010]扩增所述非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；
[0011]所述上游引物FP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
[0012]所述下游引物RP1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0013]SEQ ID No.2：TACAGCTCTTCCAGACGCATG。
[0014]SEQ ID No.3：TATCGATAAGATTGATACCA。
[0015]非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，其结构复杂，它的基因组由两层衣壳和两层外膜保护，衣壳主要由病毒编码蛋白p72构成，p72蛋白占病毒颗粒总重33％左右。本专利技术中以非洲猪瘟病毒的p72基因中的保守区设计特异性引物和探针，通过所述特异性引物和探针对非洲猪瘟病毒进行检测，其灵敏度高、特异性好、准确度高。
[0016]优选地，检测所述非洲猪瘟病毒的p72基因的探针包括探针P1和探针P2。
[0017]优选地，所述探针P1包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0018]优选地，所述探针P2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
[0019]SEQ ID No.4：TATTAGCCCCGTTACGTATC。
[0020]SEQ ID No.5：TATTAGCCATGTTACGTATC。
[0021]在本专利技术中，根据ASFV序列(如SEQ ID NO.1所示)设计特异性引物与探针，采用同一对引物配合两条存在碱基差异的探针，覆盖了ASFV的所有基因型，探针在PCR反应程序中的退火期被DNA聚合酶水解，在激发光的作用下产生荧光信号，计算对应的Ct值，从而判断样品的阴阳性。
[0022]SEQ ID NO.1：
[0023]ATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAG。
[0024]优选地，所述探针P1和探针P2的5
’
端修饰荧光素，所述探针P1和探针P2的3
’
端修饰淬灭剂。
[0025]本专利技术中，所述探针P1的荧光素为5
‑
羧基荧光素(FAM)，淬灭剂为BHQ1；所述探针P2的荧光素为FAM，淬灭剂为BHQ1。
[0026]优选地，所述检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测猪肌动蛋白基因的引物对和探针。
[0027]优选地，扩增所述猪肌动蛋白基因的引物对包括上游引物FP2和下游引物RP2。
[0028]优选地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
[0029]优选地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
[0030]优选地，检测所述猪肌动蛋白基因的探针包括探针P3。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对和探针；扩增所述非洲猪瘟病毒的p72基因的引物对包括上游引物FP1和下游引物RP1；所述上游引物FP1包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述下游引物RP1包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，其特征在于，检测所述非洲猪瘟病毒的p72基因的探针包括探针P1和探针P2；优选地，所述探针P1包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P2包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P1和探针P2的5
’
端修饰荧光素，所述探针P1和探针P2的3
’
端修饰淬灭剂。3.根据权利要求1或2所述的检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测猪肌动蛋白基因的引物对和探针；优选地，扩增所述猪肌动蛋白基因的引物对包括上游引物FP2和下游引物RP2；优选地，所述上游引物FP2包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；优选地，所述下游引物RP2包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；优选地，检测所述猪肌动蛋白基因的探针包括探针P3；优选地，所述探针P3包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；优选地，所述探针P3的5
’
端修饰荧光素，所述探针P3的3
’
端修饰淬灭剂。4.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合和反应液；优选地，所述反应液包括PCR缓冲液、酶缓冲液、DNA聚合酶和水；优选地，所述DNA聚合酶包括Taq酶。5.根据权利要求4所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测非洲猪瘟病毒的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李超，张建东，
申请(专利权)人：凡知医疗科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：