膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开一种膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于肿瘤诊断技术领域。提供的试剂盒包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及任选的HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和ANXA10，以及作为检测内参基因的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1，该试剂盒能够采用实时荧光核酸恒温扩增方法并以患者随机尿液作为待测样本高敏感性检出膀胱癌(包括初诊和复发患者)，并具有较高的阴性预测值，因此能够有效避免阴性对象进行不必要的膀胱镜检查，且可以降低检测成本。且可以降低检测成本。且可以降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针


[0001]本专利技术属于肿瘤诊断
，具体涉及一种适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的膀胱癌检测试剂盒及其专用引物和探针。

技术介绍

[0002]膀胱尿路上皮癌(Bladeder urothelial carcinoma，BUC)，亦称膀胱癌(Bladder Cancer，BC)，是指在膀胱粘膜上发生恶变的肿瘤，是泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌新发在泌尿生殖肿瘤中位居第二。
[0003]膀胱癌分为非肌层浸润型膀胱癌(NMIBC)及肌层浸润型膀胱癌(MIBC)。其中，NMIBC(新发率75％
‑
85％)包括Tis，Ta，T1期，局限于粘膜和粘膜下层。NMIBC虽然具有多发性及较高的复发性，但一般预后较好，患者的五年生存率极高；MIBC(新发率15％
‑
25％)包括T2
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T4期，侵犯至肌层以上，导致一些患者发生局部或远端转移，预后较差，五年生存率明显下降。因此，对于膀胱癌的诊断(初诊)和复发监测具有重要的意义。
[0004]目前，临床上对膀胱癌诊断和复发监测的金标准是膀胱镜检查，但由于其具有侵袭性，给患者的精神及肉体造成了巨大痛苦，尤其是进行复发监测时，定期进行膀胱镜检查更是对患者造成极大的痛苦。无创尿液检查(尿细胞学检查)替代膀胱镜诊断膀胱癌、监测复发及判断预后，一直是研究的热点。除尿细胞学检查外，目前通过尿液检查诊断和监测膀胱癌复发还主要有尿核基质蛋白22、膀胱癌肿瘤抗原、免疫
‑
细胞检测等方法，但以上这些方法的敏感性和特异性均不理想。
[0005]为了提高膀胱癌检测(诊断和复发监测)的特异性和敏感性，并实现无创检测，专利文献CN109576370A(以下称文献1)公开一种用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒，其以尿液为检测样本，并采用生物标志物基因BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1的组合对膀胱癌进行诊断和复发的监测，具有较高的检测敏感性、阴性预测值(NPV)和特异性。专利文献CN111154879A(以下称文献2)公开一种用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒，其以尿液为检测样本，并采用生物标志物基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13的组合对膀胱癌进行诊断和复发的监测，也具有较高的检测敏感性、阴性预测值(NPV)和特异性。然而，上述文献1和2公开的均是适用于PCR反应体系的检测膀胱癌标志物的组合，PCR反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长，效率较低，同时需要使用荧光定量PCR仪，增加了检测成本和患者的经济负担；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测
以下检测基因的试剂：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT；
[0007]所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的特异性检测GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1的试剂，所述GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1作为检测内参基因。
[0008]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和IANXA10。
[0009]在一些实施方式中，针对每一种基因(包括检测基因和检测内参基因)的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
[0010](1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获基因序列，所述第一引物用于与基因序列中的靶标序列特异性结合；
[0011](2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
[0012](3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
[0013]任选的，试剂盒中还包括：
[0014](4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶。
[0015]在一些实施方式中，特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:15所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
[0016]在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16
‑
SEQ ID NO:30所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
[0017]在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31
‑
SEQ ID NO:45所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
[0018]在一些实施方式中，特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:46
‑
SEQ ID NO:60所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
[0019]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括外源内标，其核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示；可选地，所述试剂盒还包括特异性检测所述外源内标的内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:92
‑
SEQ ID NO:95所示，且在所述内标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
[0020]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0021](5)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5
‑
50mM HEPES、50
‑
500mM NaCl、0.5
‑
1.5％ SDS、1
‑
10mM EDTA；和/或
[0022](6)矿物油；和/或
[0023](7)阳性对照：分别含有以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT；所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的特异性检测GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1的试剂，所述GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1作为检测内参基因。2.根据权利要求1所述的膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和IANXA10。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，针对每一种基因(包括检测基因和检测内参基因)的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获基因序列，所述第一引物用于与基因序列中的靶标序列特异性结合；(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；任选的，试剂盒中还包括：(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:15所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16
‑
SEQ ID NO:30所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31
‑
SEQ ID NO:45所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:46
‑
SEQ ID NO:60所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外源内标，其核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示；可选地，所述试剂盒还包括特异性检测所述外源内标的内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:92
‑
SEQ ID NO:95所示，且在所述内标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。6.根据权利要求3
‑
5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5
‑
50mM HEPES、50
‑
500mM NaCl、0.5
‑
1.5％
SDS、1
‑
10mM EDTA；和/或(6)矿物油；和/或(7)阳性对照：分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或(8)阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或(9)阳性标准品：浓度梯度分别为102‑
107拷贝/μL的分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或(10)标准曲线：分别针对以下基因的纵坐标为靶标dt值/内标dt值、横坐标为浓度log值的标准曲线：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1。7.根据权利要求3
‑
6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％十二烷基硫酸锂、1
‑
50μΜ所述的特异性捕获探针、50
‑
500mg/L磁珠、25
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【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，冉鹏展，张适麒，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：