本发明专利技术公开一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括GBS核酸提取液、GBS扩增检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于B群链球菌实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对B群链球菌的快速、准确检测，并且灵敏度高，扩增产物RNA易降解，不会引起样本交叉污染和环境污染。不会引起样本交叉污染和环境污染。
【技术实现步骤摘要】
B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别涉及特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)cfb基因RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
技术介绍
[0002]无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)在兰氏抗原分类中属于B群，B群目前只发现这一种细菌，所以一般也称为B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)。GBS为一种β溶血的革兰阳性球菌，成对或呈短链状排列，根据细菌的荚膜多糖不同，GBS可分为Ia、Ib、Ic、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX等。GBS是围产期和新生儿感染疾病的致病菌，引起孕产妇的绒毛膜羊膜炎，导致流产、胎膜早破及宫内感染，也可导致新生儿发生肺炎、脑膜炎、败血症等，因此中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南建议》(2018版)中明确将GBS筛查作为高危孕妇的备查项目，且最佳检测时间在35～37周。
[0003]目前，对GBS进行检测的方法主要包括：传统的细菌培养方法和实时荧光PCR检测方法。其中传统的细菌培养方法作为病原微生物检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求；实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、耗时短、通量相对较高的优势，在GBS的筛查中发挥重要的作用。例如专利文献CN113249508A(以下称文献1)公开一种用于检测B族链球菌的特异性引物和探针，其以B族链球菌ScpB基因为靶基因设计得到，对B族链球菌模拟临床样本能检测出的最低拷贝数为10copies/μL。然而该文献1公开的基于PCR原理的检测方法在反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长，效率较低，同时需要使用专用的荧光PCR仪，增加了检测成本；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
[0004]为了克服PCR方法中检测GBS耗时较长、需要专用PCR仪器等问题，张晓彤等人(等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究，中国病原生物学杂质，2018年2月，第13卷第2期，P112
‑
115；以下称文献2)建立一种可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法，其根据GBS的cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物，能够在恒温条件下快速(LAMP方法在63℃下恒温45min；PRA方法在40℃下恒温15min)完成目的基因的扩增反应过程，且均不依赖于特定仪器，因此检测效率较高，且可节约检测成本。然而，上述文献2公开的两种方法(LAMP和PRA)对GBS的最低检出浓度仅能达到0.01ng DNA/μl，且反应产物仍为DNA，其不易降解，仍容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
技术实现思路
[0005]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
[0006](1)GBS核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；
[0007](2)GBS扩增检测液：其包含第二引物、靶标检测探针和所述第一引物，其中所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
[0008](3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；
[0009]其中：
[0010]所述捕获探针包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成；
[0011]所述第一引物包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或由其组成；
[0012]所述第二引物包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成；
[0013]所述靶标检测探针包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
[0014]在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。
[0015]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0016](4)阳性对照：含有B群链球菌核酸的体系；和/或
[0017](5)阴性对照：不含有B群链球菌核酸的体系。
[0018]在一些实施方式中，所述GBS核酸提取液的组分包括：1
‑
50μΜ所述的捕获探针、和25
‑
150pmol/mL所述的第一引物。
[0019]在一些实施方式中，所述GBS扩增检测液的组分包括：250
‑
750pmol/mL所述的第二引物、143
‑
857pmol/mL所述的第一引物、和143
‑
857pmol/mL所述的靶标检测探针。
[0020]在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分包括：16000
‑
160000U/mL的M
‑
MLV反转录酶、8000
‑
80000U/mL的RNA聚合酶、2
‑
10mM HEPES pH7.5、10
‑
100mM N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸、0.04
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0.4mM乙酸锌、10
‑
100mM海藻糖、40
‑
200mM Tris
‑
HCl pH 8.0、40
‑
200mM KCl、0.01
‑
0.5mM EDTA、0.1
‑
1％(v/v)Triton X
‑
100和20
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50％(v/v)甘油。
[0021]在一些实施方式中，所述阳性对照为B群链球菌培养物或其稀释物。
[0022]本专利技术另一方面提供一种B群链球菌cfb基因RNA实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其包括：
[0023]核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的捕获探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的靶标检测探针，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)GBS核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；(2)GBS扩增检测液：其包含第二引物、靶标检测探针和所述第一引物，其中所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；(3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；其中：所述捕获探针包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成；所述第一引物包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或由其组成；所述第二引物包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成；所述靶标检测探针包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(4)阳性对照：含有B群链球菌核酸的体系；和/或(5)阴性对照：不含有B群链球菌核酸的体系。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述GBS核酸提取液的组分包括：1
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50μΜ所述的捕获探针、和25
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150pmol/mL所述的第一引物；所述GBS扩增检测液的组分包括：250
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750pmol/mL所述的第二引物、143
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857pmol/mL所述的第一引物、和143
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857pmol/mL所述的靶标检测探针；所述SAT酶液的组分包括：16000
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160000U/mL的M
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MLV反转录酶、8000
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80000U/mL的RNA聚合酶、2
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10mM HEPES pH7.5、10
‑
100mM N
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乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，张帝，王文迪，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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