一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种多重qPCR技术检测样本中四种细菌的探针引物组及检测方法。本发明专利技术针对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌四种临床高频检出病原菌的基因序列，设计特异性引物和探针，利用多重qPCR同时鉴定样本中是否存在四种细菌的感染，优化了反应条件和检测流程，缩短检测时间，对临床感染患者而言，快速准确的鉴别诊断病原体对辅助治疗、用药和改善预后具有重要意义。同时，该多重引物探针组和检测方法的特异性好，准确性高、重复性好，还具有快速、实用、低成本和操作简便的特点，满足样本需求量大的临床检验实验室对四种细菌的检测需求。验实验室对四种细菌的检测需求。验实验室对四种细菌的检测需求。

【技术实现步骤摘要】
一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种利用多重qPCR技术检测样本中多种细菌的方法。

技术介绍

[0002]鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)属于革兰氏阴性菌，是一种严格需氧、非乳糖发酵的条件致病菌，可广泛存在大自然中。该菌已经成为医院感染的主要来源，尤其是重症监护室，该菌通常会引起菌血症，肺炎，脑膜炎，腹膜炎，心内膜炎，以及泌尿道和皮肤感染等。医院感染性败血症和脓毒血症是不动杆菌属引起的最严重感染性疾病，病死率为32.0％。
[0003]肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，其对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。肺炎克雷伯氏菌为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病，尤其以败血症最为严重。其还经常通过污染的人工呼吸器、雾化器或各种导管侵入人体导致严重的医院内感染。
[0004]嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种严格需氧革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，也可寄居于人的呼吸道和肠道中，为条件致病菌，是一种主要的医源感染的病原菌。该菌主要引起呼吸道感染，还可引起医院获得性肺炎、血流感染、腹腔感染、中枢神经系统感染、泌尿系统感染、皮肤软组织感染等。其医院感染有逐年上升的趋势，且其分离率在非发酵菌中，仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。
[0005]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)原称绿脓杆菌，是广泛存在于自然界中的专性需氧革兰氏阴性杆菌。该菌为常见的条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。该菌经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，还是尿路感染的常见病原菌。其引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外，HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染。
[0006]长期以来，细菌感染的常规检测方法是培养法，其一直被视为病原体检测的“金标准”，但是该方法培养条件要求严格、耗时、易污染，且检出率低，无法满足快速精准检测的要求。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal
‑
timePCR)是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点。由此基础上发展而来的多重荧光定量PCR在病原的检测及鉴别诊断中变得越来越重要。因此迫切需要单管PCR同时定量检测以上4种病原菌的检测方法，使其在快速检测的同时可以节约成本，及时有效的为急危重症患者的治疗方案的制定提供参考依据。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是将临床高频检出的四种病原菌通过多重荧光定量PCR技术来实现同时检测，弥补单重荧光定量PCR对多样本量检测时的高成本、费时耗力的缺点，降低劳动强度，缩短检测周期，减轻临床实验压力，简化操作流程，具有检测快速、灵敏度高、特异性强、操作方便等优点。
[0008]一种多重qPCR检测细菌的探针引物组，用于单反应同时检测鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌的四重荧光PCR反应，包括：
[0009]用于对鲍曼不动杆菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示；
[0010]用于对肺炎克雷伯菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示；
[0011]用于对嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.13
‑
14所示；
[0012]用于对铜绿假单胞菌检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10
‑
11所示。
[0013]所述的探针引物组中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：
[0014]用于对鲍曼不动杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0015]用于对肺炎克雷伯菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0016]用于对嗜麦芽窄食单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
[0017]用于对铜绿假单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0018]所述探针的5
’
端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。
[0019]所述探针的3
’
端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.15所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。
[0020]本专利技术提供了一种检测方法，含有上述的四重荧光PCR引物组合和荧光探针组合，可以采用荧光定量PCR单反应同时检测鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌。
[0021]所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。
[0022]本专利技术提供了一种基于多重荧光qPCR技术同时检测四种高频检出病原菌的检测方法，包括以下步骤：
[0023]1)从样品中提取核酸；
[0024]2)以提取的核酸为模板，用上述所述的引物组及上述所述探针组进行多重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；
[0025]3)根据荧光信号判定样品中是否含有鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌。
Circulating Nucleic Acid Kit(50)：55114)；探针和引物合成(南京金斯瑞生物公司)；HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix(翌圣：11211ES08)。
[0044]实验仪器：荧光定量PCR仪(Bio
‑
Rad：CFX384)；微孔板迷你离心机(其林贝尔：BE
‑
6100)。
[0045]实施例1探针引物设计及测试
[0046]1)探针引物设计
[0047]通过对美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站中鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌基因组中特异性序列比对，找到高度保守的核苷酸序列，并结合文献，设计鲍曼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，用于单反应同时检测鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌的四重荧光PCR反应，包括：用于对鲍曼不动杆菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示；用于对肺炎克雷伯菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示；用于对嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.13
‑
14所示；用于对铜绿假单胞菌检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10
‑
11所示。2.根据权利要求1所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，所述的探针引物组中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：用于对鲍曼不动杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于对肺炎克雷伯菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于对嗜麦芽窄食单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；用于对铜绿假单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。3.根据权利要求1所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，所述探针的5
’
端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。4.根据权利要求3所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，刘佳，赵忞超，那成龙，刘思思，崔月利，郭垚，吴卫卫，蒋文，
申请(专利权)人：南京迪飞医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：