一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法。所述多重荧光PCR体系包括3组引物探针组合：青春双歧杆菌引物对及探针、动物双歧杆菌引物对及探针和两歧双歧杆菌引物对及探针，其序列依次为SEQ ID No.1～9。所述引物探针组合仅对各自双歧杆菌菌种的目标片段进行特异性扩增，不会对其他菌种进行非特异性扩增，检测时间短、操作简单、结果可靠，适用于益生菌制品中青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌成分快速检验。速检验。速检验。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法。

技术介绍

[0002]双歧杆菌(Bifidobacterium)是一类广泛存在于人和禽畜肠道的益生菌，厌氧生长、无孢子形成，与维护肠道微生物平衡、提高机体免疫力、维持宿主健康密切相关。医学上，常用于急慢性腹泻、各种肠炎及肠道菌群失调症的防治、用于炎症性肠病的辅助用药。常见用于益生菌组分的双歧杆菌包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等等。经过多年的研究发现，动物双歧杆菌对婴幼儿的营养和预防肠道疾病具有重要作用；青春双歧杆菌则可治疗慢性腹泻、便秘，还有显著的抗衰老作用；两歧双歧杆菌对于治疗肠道炎症以及消化系统紊乱具有独特的效果。
[0003]市面上的益生菌制品是指含有大量益生菌的活菌制剂，或者含有其代谢产物或(和)促进生长因子的产品。以由于受到研发生产技术的限制，益生菌制品市场存在产品质量参差不齐的状况。由于缺乏有效的益生菌鉴定技术手段及监管措施，市售益生菌制品存在如益生菌标识与实际使用菌株不一致等现象。因此，急需建立一种能够准确快速鉴别多种益生菌的方法，用以应满足大规模摸底筛查和现场检测的需要。
[0004]实时荧光PCR技术是近年来得到广泛应用的快速核酸检测技术，具有灵敏度高、检测周期短、特异性强等优点。目前，常规检测大多使用的是单重实时荧光定量PCR，可同时检测多个目的基因的检测体系较少。然而无论是在常规食品抽检，还是在应对突发和重大食品安全事故中，都需要进行大规模快速检测。因此建立一种可以同时检测多种双歧杆菌的荧光定量PCR体系并开发成试剂盒，具有非常重要的实践意义和实用价值。
[0005]细菌16S是用于菌种鉴定的最常用基因序列，但是由于乳杆菌属内许多种的16S rDNA基因序列具有较高同源性，利用该基因仅能鉴定到属而无法准确到种。鉴于此，本专利技术对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌共有的热休克蛋白
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60(HSP
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60)基因部分序列构建系统发育树并进行比对分析，设计种间特异性引物，采用多重荧光定量PCR技术，通过单一体系成功将三者区分开来，从而实现准确快速鉴别三种双歧杆菌的目的。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法的技术方案。
[0007]本专利技术具体采用以下技术方案：
[0008]本专利技术第一方面提供了同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，所述探针引物组包含分别针对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌的热休克蛋
白
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60(HSP
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60)基因的引物对与探针；
[0009]其中，针对青春双歧杆菌HSP
‑
60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.1所示的Badol_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.2所示的Badol_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.3所示的Badol_hsp60_P；
[0010]针对动物双歧杆菌HSP
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60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.4所示的Banim_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.5所示的Banim_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.6所示的Banim_hsp60_P；
[0011]针对两歧双歧杆菌HSP
‑
60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.7所示的Bbifi_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.8所示的Bbifi_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.9所示的Bbifi_hsp60_P。
[0012]进一步，所述青春双歧杆菌HSP
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60基因的探针序列5
’
端修饰有FAM，所述动物双歧杆菌HSP
‑
60基因的探针序列5
’
端修饰有HEX，所述两歧双歧杆菌HSP
‑
60基因的探针序列5
’
端修饰有ROX；所有探针的3
’
端均修饰有BHQ1。
[0013]本专利技术第二方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。
[0014]进一步，该试剂盒包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2
×
PCR Mix，包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、pH 8.3的Tris
‑
HCl 20mM、MgCl
2 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；反应液B为Primer Mix，包括三种双歧杆菌的引物Badol_hsp60_F、Badol_hsp60_R、Banim_hsp60_F、Banim_hsp60_R、Bbifi_hsp60_F和Bbifi_hsp60_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包括探针Badol_hsp60_P、Banim_hsp60_P、Bbifi_hsp60_P，各自浓度为3.3nM。
[0015]进一步，该试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为根据青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌目的基因构建的质粒按照1:1:1比例的混合物。
[0016]本专利技术第三方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测方法，其包括以下步骤：
[0017]1)提取待测样本的基因组DNA备用；
[0018]2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括如权利要求3
‑
5所述的PCR试剂盒；
[0019]3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在上述三种双歧杆菌。
[0020]进一步，所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，加入50ng DNA模板，补水至25μL；
[0021]PCR程序为按照95℃10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环程序进行荧光定量PCR反应；每个循环结束收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中某一通道基因的Ct值及扩增曲线进行阳性判断。
[0022]进一步，所述步骤3)中判断标准为：
[0023]a)若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；
[0024]b)若待测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述探针引物组包含分别针对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌的热休克蛋白
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60(HSP
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60)基因的引物对与探针；其中，针对青春双歧杆菌HSP
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60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.1所示的Badol_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.2所示的Badol_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.3所示的Badol_hsp60_P；针对动物双歧杆菌HSP
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60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.4所示的Banim_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.5所示的Banim_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.6所示的Banim_hsp60_P；针对两歧双歧杆菌HSP
‑
60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.7所示的Bbifi_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.8所示的Bbifi_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.9所示的Bbifi_hsp60_P。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述青春双歧杆菌HSP
‑
60基因的探针序列5
’
端修饰有FAM，所述动物双歧杆菌HSP
‑
60基因的探针序列5
’
端修饰有HEX，所述两歧双歧杆菌HSP
‑
60基因的探针序列5
’
端修饰有ROX；所有探针的3
’
端均修饰有BHQ1。3.一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。4.如权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于：包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2
×
PCR Mix，包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、pH 8.3的Tris
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HCl 20mM、MgCl
2 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁媛媛，刘鹏鹏，夏琪琪，黄甜甜，郑方媛，盛华栋，
申请(专利权)人：浙江方圆检测集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：