一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记及其应用，该SNP标记为c84804

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记及其应用


[0001]本专利技术属于SNP标记
，具体涉及一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记及其应用。

技术介绍

[0002]核桃黑斑病是核桃属植物的一种细菌性侵染病害，病原菌为核桃黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.juglandis)，核桃感病后主要在叶片和果实上表现出症状，高温高湿的雨季发病较严重。该病会造成叶片变为黑色或枯焦，果实变黑干瘪早落，严重时会造成整枝枯死，影响核桃品质和产量。不同核桃品种对细菌性黑斑病的抗性不同，同一品种在年与年间的抗病性有略微差异，但不同品种间的大致趋势是一致的，最抗病和最感病品种差异显著。目前选育推广抗病品种是防治黑斑病的有效措施，但目前抗病品种少，推广难。
[0003]目前主要是通过人工接种和田间调查两种方式，鉴定不同核桃品种(无性系)对黑斑病的抗性。两种方式都是通过分级法对实验材料进行分级，根据发病率和病情指数来判断不同品种(无性系)对黑斑病的抗性，不同的是人工接种一般是在室内可控条件下采用喷雾、针刺等方法在盆栽或离体叶片上接种，而田间调查是统计自然发病状况，受树势、营养条件等的影响，田间调查的结果比人工接种更准确，但黑斑病受气候影响较大，高温高湿有助于病原菌的侵染和蔓延，田间调查容易受气候影响，因此，在进行抗性鉴定时，结合田间调查和人工接种，抗性鉴定结果跟品种实际性状会更一致。但是，目前的人工接种和田间调查的方式均存在的周期长，准确性差的问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记及其应用，该SNP标记可准确的检测出核桃的抗黑斑病形态，通过基因手段进行检测，可大大缩短检测周期，提高检测准确性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记，该SNP标记为c84804
‑
s3，该SNP标记的坐标为300，该标记的核苷酸碱基为C或A，该SNP标记对应的基因型为A/A纯合型时，为高抗黑斑病的基因型，该SNP标记对应的基因型为C/C纯合型时，为高感黑斑病的基因型，该SNP标记对应的基因型为C/A杂合型时，为中等抗黑斑病的基因型。
[0007]一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记，该SNP标记为c84804
‑
s3，该SNP标记序列自5
’
端起第300位碱基为C或A。
[0008]一种用于检测核桃抗黑斑病的引物组，该引物组包括引物序列1：5
’‑
TCAAGTATGTGAAGCAGC
‑3’
；引物序列2：5
’‑
TCAAGTATGTGAAGCAGA
‑3’
和引物序列3：TATTTAGCGAGCCAAGAC。
[0009]一种用于检测上述SNP标记的试剂盒，包含上述的引物组。
[0010]上述的SNP标记或引物组或试剂盒在核桃抗病育种中的应用。
[0011]一种检测核桃抗黑斑病的方法，通过对待测核桃进行权利要求1所述的SNP标记的检测，确定核桃的抗黑斑病类型。
[0012]进一步地，具体操作如下：
[0013](1)提取核桃基因组DNA；
[0014](2)利用权利要求2中的引物组，将步骤(1)中的待测核桃基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
[0015](3)对PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果，基于所述测序结果，确定待检测核桃的SNP标记的基因型，并基于待测核桃的SNP标记的进行，确定待测核桃的抗黑斑病类型。
[0016]本专利技术所产生的有益效果为：
[0017]本专利技术中在转录组测序的基础上，采用等位基因特异PCR对SNP标记进行基因分型，开发出与核桃黑斑病相关的SNP标记，该SNP标记为c84804
‑
s300，并针对该标记设计出特异性引物组，该引物组具有较高的灵敏度，能够快速的对高抗和高感材料进行快速分型，可用于抗病良种选育。
附图说明
[0018]图1为差异基因维恩图；
[0019]图2为部分特异引物对铁核桃和香玲材料基因组DNA扩增情况的结果图；
[0020]图3为28号引物扩增结果图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0022]一、用于鉴定核桃抗黑斑病的SNP标记及专用引物组的获得
[0023]1材料方法
[0024]1.1材料
[0025]病原菌材料：核桃黄单胞杆菌由四川农业大学林学院林木病理实验室采集分离。
[0026]供试植物材料：2a生铁核桃和香玲实生苗，种子由四川农业大学现代农业研发基地提供。基于田间表现和前期人工接种鉴定，构建了核桃黑斑病抗感差异群体，差异群体材料共12个品种(系)，其田间抗性表现见表1，叶片材料采自四川农业大学现代农业研发基地。分子标记抗性鉴定应用的核桃材料分别采自四川农业大学现代农业研发基地和德昌县核桃、山核桃国家林木种质资源库，共32个品种(系)。
[0027]转录组数据：采用多糖多酚类植物RNA提取试剂盒(华越洋生物)提取抗感差异显著的铁核桃和香玲两个品种的健康叶片和发病叶片的RNA，共4个转录本，反转录成cDNA后，利用Agilent Bioana
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lyzer 2100系统评估文库质量。基于Illumina HiSeq平台对文库进行双末端测序获得相关数据。
[0028]表1 12份供试核桃黑斑病抗感差异品种(系)来源及田间抗性表现
[0029][0030]1.2试验方法
[0031]1.2.1核桃叶片基因组DNA提取
[0032]采集不同核桃品种(系)的叶片，经液氮处理后，保存在
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80℃冰箱。核桃叶片基因组DNA使用北京天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取，采用1％的琼脂糖凝胶电泳和超微分光光度计检测DNA的质量和浓度，使用双蒸水(ddH2O)将提取DNA浓度稀释至40ng/uL，保存于
‑
20℃冰箱备用。
[0033]1.2.2抗病基因和SNP标记筛选
[0034]依据转录组测序数据，分析健康铁核桃、发病铁核桃、健康香玲、发病香玲4个转录本的基因表达水平，采用DESeq软件，筛选出具有显著差异的Unigenes，筛选阈值为padj＜0.05。比对Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss
‑
prot、KEGG、GO数据库，对基因功能进行注释。通过变异检测软件GATK2进行SNPcalling，过滤掉质量值小于30，距离小于5的SNP。根据抗病基因所特有的保守结构特征，挑选出铁核桃和香玲的reads值有显著差异的编码区非同义突变标记。具体如下：
[0035](1)将Trinity拼接得到的转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测核桃抗黑斑病的SNP标记，其特征在于，该SNP标记为c84804
‑
s3，该SNP标记序列自5
’
端起第300位碱基为C或A。2.一种用于检测核桃抗黑斑病的引物组，其特征在于，该引物组包括引物序列1：5
’‑
TCAAGTATGTGAAGCAGC
‑3’
；引物序列2：5
’‑
TCAAGTATGTGAAGCAGA
‑3’
和引物序列3：TATTTAGCGAGCCAAGAC。3.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩珊，李鸿朋，阮若玉，袁欢，张弛，朱天辉，刘应高，李姝江，林恬恬，谯天敏，杨春琳，李书颖，陈星羽，罗婷婷，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：