检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对、锁核酸探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对和锁核酸探针、试剂盒应用。该检测呼吸道非典型病原体核酸的锁核酸探针（LNA

【技术实现步骤摘要】
检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对、锁核酸探针、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及检测呼吸道非典型病原体的扩增引物对、锁核酸探针、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]百日咳鲍特菌，俗称百日咳杆菌，是一种革兰阴性杆菌，是百日咳的主要致病菌，百日咳属于呼吸道传染病，在婴幼儿中病死率高。军团菌也是一种革兰阴性杆菌，可引起以肺部为主的全身性感染，统称为军团病，其中85%以上由嗜肺军团菌引起。百日咳鲍特菌和嗜肺军团菌虽然都是细菌，但是它们营养要求苛刻，体外不容易培养。衣原体是专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，分离培养的方法是细胞培养和鸡胚接种，因此操作非常繁琐，在临床工作中难以实现。在衣原体中，肺炎衣原体和沙眼衣原体都可以引起呼吸道感染。支原体是最小的原核细胞型微生物，其中的肺炎支原体是引起人类呼吸道感染的常见病原体之一。肺炎支原体可在无生命培养基中培养，但是分离培养的阳性率不高，培养敏感性仅有40%左右，且耗时长，故不适用于临床快速诊断。
[0003]对难以培养的病原体进行检测，常用免疫学方法。免疫学方法虽然有特异性强、敏感性较高、操作简单快速等优点，但大多每次仅能检测一种病原体，而大多数呼吸道感染为多种病原体共同感染，仅靠常规检测是难以进行快速鉴别诊断的。多重荧光定量PCR检测平台是目前技术最为成熟的开放平台，建设和使用成本也相对较低，是目前新试剂研发的重点。把多种病原体检测集中到一个封闭体系中同时进行，既节约了成本又节省了时间，而且灵敏度高，大大提高病原体的检出率。
[0004]根据国家食品药品监督管理总局网站（https://www.nmpa.gov.cn/）上公布的上述5种呼吸道病原体的检测试剂盒注册信息，发现这些病原体的检测试剂盒虽有PCR法，但常见的仍然是以各种免疫学方法为主；目前，用PCR检测上述病原体的试剂盒中，能联合检测上述提到的2种或以上病原体的试剂盒只有两种类型，即肺炎支原体及肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒，以及沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸检测试剂盒。具体见表1。
[0005]表1国家食药监公布的所述5种呼吸道非典型病原体的检测试剂盒的方法
锁核酸(Lockednucleicacids，LNA)是新型的核酸类似物，它包含了2'
‑
氧4'
‑
碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，可提高杂交效率和稳定性。LNA标记的探针可增强双链体的热稳定性，每增加一个单体LNA分子将导致其熔点提升8℃，通过调整LNA碱基在探针中的位置来调节最佳熔点(Tm)和杂交特异性。含有LNA的PCR探针长度较短，可以增加引物和探针设计的灵活性，比TaqMan
‑
MGB法更优越，可显著扩大检测的环境限制，同时允许在单试管中进行更复杂的试验，特别适用于多重实时定量PCR系统。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测呼吸道非典型病原体的扩增引物对、锁核酸探针、试剂盒及应用，以解决现有技术中，大多检测每次仅能检测一种病原体，而大多数呼吸道感染为多种病原体共同感染，仅靠常规检测难以进行快速鉴别诊断的技术问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供的检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对，包括针对百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和沙眼衣原体的扩增引物对；所述百日咳鲍特菌的扩增引物对序列如 SEQ ID No .1 及 SEQ ID No .2 所示；所述嗜肺军团菌的扩增引物对序列如 SEQ ID No .3 及 SEQ ID No .4 所示；所述肺炎衣原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .5 及 SEQ ID No .6 所示；所述肺炎支原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .7 及 SEQ ID No .8 所示；所述沙眼衣原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .9 及 SEQ ID No .10 所示。
[0008]进一步的，所述的扩增引物对分为A、B两组：A组包括百日咳鲍特菌扩增引物对、嗜肺军团菌扩增引物对；B组包括肺炎衣原体扩增引物对、肺炎支原体扩增引物对、沙眼衣原体扩增引物对。
[0009]本专利技术提供的检测呼吸道非典型病原体核酸的锁核酸探针，包括针对百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和沙眼衣原体的锁核酸探针；
所述百日咳鲍特菌的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.11所示，5
’
端标记的荧光基团是FAM，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述嗜肺军团菌的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.12所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述肺炎衣原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.13所示，5
’
端标记的荧光基团是FAM，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述肺炎支原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.14所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述沙眼衣原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.15所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2。
[0010]进一步的，所述的锁核酸探针分为A、B两组：A组包括百日咳鲍特菌的锁核酸探针、嗜肺军团菌的锁核酸探针；B组包括肺炎衣原体的锁核酸探针、肺炎支原体的锁核酸探针、沙眼衣原体的锁核酸探针；同一组内的不同的锁核酸探针5
’
端连接的荧光基团不同。
[0011]本专利技术提供的检测呼吸道非典型病原体核酸的试剂盒，其特征在于，包括检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对和锁核酸探针。
[0012]进一步的，还包括用于PCR
‑
探针法的实时荧光定量PCR反应预混液；所述PCR反应预混液是含有TaqDNA聚合酶、Mg
2+
、dNTPs用于PCR扩增的试剂。
[0013]进一步的，还包括内标对照，所述的内标对照是用于检测内源性内参基因，编码人甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因的扩增引物对和锁核酸探针，所述甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶的扩增引物对序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，与所述扩增引物对对应的锁核酸探针序列如SEQ ID No .18 所示；锁核酸探针5
’
端荧光基团为 ROX，3
’
端淬灭基团为 BHQ2。
[0014]进一步的，还包括阴性对照和阳性对照；所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照是包括了所述的呼吸道非典型病原体靶基因和内参基因片段的克隆质粒，其中含有的呼吸道非典型病原体靶基因和内参基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No .19～SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对，其特征在于，包括针对百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和沙眼衣原体的扩增引物对；所述百日咳鲍特菌的扩增引物对序列如 SEQ ID No .1 及 SEQ ID No .2 所示；所述嗜肺军团菌的扩增引物对序列如 SEQ ID No .3 及 SEQ ID No .4 所示；所述肺炎衣原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .5 及 SEQ ID No .6 所示；所述肺炎支原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .7 及 SEQ ID No .8 所示；所述沙眼衣原体的扩增引物对序列如 SEQ ID No .9 及 SEQ ID No .10 所示。2.根据权利要求1所述的检测呼吸道非典型病原体核酸的扩增引物对，其特征在于，所述的扩增引物对分为A、B两组：A组包括百日咳鲍特菌扩增引物对、嗜肺军团菌扩增引物对；B组包括肺炎衣原体扩增引物对、肺炎支原体扩增引物对、沙眼衣原体扩增引物对。3.一种检测呼吸道非典型病原体核酸的锁核酸探针，其特征在于，包括针对百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和沙眼衣原体的锁核酸探针；所述百日咳鲍特菌的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.11所示，5
’
端标记的荧光基团是FAM，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述嗜肺军团菌的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.12所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述肺炎衣原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.13所示，5
’
端标记的荧光基团是FAM，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述肺炎支原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.14所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2；所述沙眼衣原体的锁核酸探针的序列如SEQ ID No.15所示，5
’
端标记的荧光基团是HEX，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ2。4.根据权利要求3所述的检测呼吸道非典型病原体核酸的锁核酸探针，其特征在于，所述的锁核酸探针分为A、B两组：A组包括百日咳鲍特菌的锁核酸探针、嗜肺军团菌的锁核酸探针；B组包括肺炎衣原体的锁核酸探针、肺炎支原体的锁核酸探针、沙眼衣原体的锁核酸探针；同一组内的不同的锁核酸探针5
’
端连接的荧光基团不同。5.一种检测呼吸道非典型病原体核...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢成彬，王频佳，苏喆，吴雨露，林雪萍，罗红权，
申请(专利权)人：四川省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：