一种用于检测胆管癌的甲基化标志物、引物探针组合物和试剂盒及应用制造技术

一种用于检测胆管癌的甲基化标志物、引物探针组合物和试剂盒及应用，涉及体外检测技术领域；甲基化标志物包括以下基因中任意两种以上的基因组合的甲基化：NGLY1、HOAG1和HOOK1基因；用于检测NGLY1基因甲基化的引物探针组合物的碱基序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测胆管癌的甲基化标志物、引物探针组合物和试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于体外检测
，具体涉及一种用于检测胆管癌的甲基化标志物、引物探针组合物和试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]胆管癌(cholangiocarcinoma)统指胆管系统衬覆上皮发生的恶性肿瘤，按所发生的部位可分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)两大类。ICC起源于肝内胆管及其分支至小叶间细胆管树的任何部位的衬覆上皮；ECC又以胆囊管与肝总管汇合点为界分为肝门部胆管癌和远端胆管癌。胆管癌具有高度侵袭性，通常很难被发现，发现后往往进入中晚期，死亡率很高；临床可采用手术治疗、放射治疗、化学治疗等方法进行治疗，但预后较差；因此胆管癌的早期发现、早期诊断、早期治疗具有极大的意义。
[0003]目前，胆管癌的肿瘤标志物中最具参照价值的有：CA19
‑
9、CA125、癌胚抗原(CEA)；约85％的胆管癌患者伴有CA19
‑
9升高，但是CA19
‑
9升高也可见由其他原因的梗阻性黄疸导致，胰腺、胃恶性肿瘤及严重肝损伤均可常伴有CA19
‑
9升高；而其它的肿瘤标志物的灵敏性和特异性均比较低。随着分子生物学的飞速发展及高通量测序技术的出现，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多。研究结果表明，DNA甲基化与癌症的发生有着密切的关系，在许多癌症中都发现存在DNA甲基化异常的现象。DNA甲基化是一种常见的表观遗传(epigenetic)修饰，在DNA甲基转移酶催化下，利用S－腺苷甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5－甲基胞嘧啶，其对基因的表达调控有着至关重要的作用。DNA甲基化具有一定的稳定性，它是癌症发生中的早期事件，因此DNA的甲基化异常可以作为一种癌症诊断的生物标志物。但是目前关于胆管癌的DNA甲基化的研究报道较少，其甲基化检测的灵敏度与特异性也未满足人们的要求。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一提供一种用于检测胆管癌的甲基化标志物，对胆管癌具有较高的灵敏性和特异性。
[0005]本专利技术的目的之二提供一种用于检测胆管癌的甲基化标志物在制备胆管癌的筛查和辅助诊断试剂中应用。
[0006]本专利技术的目的之三在于提供一种用于检测胆管癌的引物探针组合物。
[0007]本专利技术的目的之四在于提供一种用于检测胆管癌的试剂盒，其准确度高、便捷性好，适用于胆管癌的筛查、辅助诊断和预后评估。
[0008]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0009]一种用于检测胆管癌的甲基化标志物，包括以下基因中任意两种以上的基因组合的甲基化：NGLY1、HOAG1和HOOK1基因。
[0010]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0011]一种用于检测胆管癌的甲基化标志物在制备胆管癌的筛查和辅助诊断试剂中应用。
[0012]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0013]一种用于检测胆管癌的引物探针组合物，包括用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因中两种以上的基因甲基化的引物对和对应的探针；
[0014]用于检测NGLY1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
[0015]用于检测HOAG1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
[0016]用于检测HOOK1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7
‑
8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。
[0017]进一步地，还包括用于检测内参基因的内参引物对和对应的内参探针，所述内参探针标记荧光基团与分别用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因甲基化的探针的荧光基团均不相同。
[0018]进一步地，所述内参基因为GAPDH、ACTB和RPⅡ中的任一种。
[0019]进一步地，用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因甲基化的探针和内参探针的5
’
端标记有FAM、VIC和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。
[0020]进一步地，所述内参基因为GAPDH基因，用于检测GAPDH基因的内参引物对的碱基序列如SEQ ID NO:10
‑
11所示，内参探针的碱基序列如SEQ ID NO:12所示。
[0021]本专利技术的目的之四采用如下技术方案实现：
[0022]一种用于检测胆管癌的试剂盒，包括所述的用于检测胆管癌的引物探针组合物。
[0023]进一步地，其检测方法包括以下步骤：
[0024]1)提取游离DNA；
[0025]2)将所述游离DNA进行甲基化转化，得到转化样本；
[0026]3)以所述转化样本为模板，利用所述的检测胆管癌的引物探针组合物进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
[0027]进一步地，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：
[0028]第一步：温度94
‑
96℃下反应4
‑
6min，循环1
‑
2次；
[0029]第二步：温度94
‑
96℃下反应14
‑
16s，然后温度65
‑
67℃下反应28
‑
32s，循环18
‑
22次；
[0030]第三步：温度94
‑
96℃下反应9
‑
11s，然后温度61
‑
63℃下反应30
‑
32s，采集荧光，循环38
‑
42次。
[0031]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0032]本专利技术的一种用于检测胆管癌的甲基化标志物，包括NGLY1、HOAG1和HOOK1基因中两种以上的基因组合甲基化，对胆管癌具有较高的灵敏性和特异性。
[0033]本专利技术的一种用于检测胆管癌的引物探针组合物，可对NGLY1、HOAG1和HOOK1基因甲基化进行特异性扩增和标记，灵敏度高，特异性强，适用于胆管癌的筛查、辅助诊断和预
后评估。
[0034]本专利技术的一种用于检测胆管癌的试剂盒，其准确度高、便捷性好、稳定性高，且采集临床样本简单方便，检测效率高。
附图说明
[0035]图1为NGLY1基因甲基化的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH内参基因，线2为NGLY1基因。
[0036]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胆管癌的甲基化标志物，其特征在于，包括以下基因中任意两种以上的基因组合的甲基化：NGLY1、HOAG1和HOOK1基因。2.一种权利要求1所述的用于检测胆管癌的甲基化标志物在制备胆管癌的筛查和辅助诊断试剂中应用。3.一种用于检测胆管癌的引物探针组合物，其特征在于，包括用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因中两种以上的基因甲基化的引物对和对应的探针；用于检测NGLY1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；用于检测HOAG1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；用于检测HOOK1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7
‑
8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。4.如权利要求3所述的用于检测胆管癌的引物探针组合物，其特征在于：还包括用于检测内参基因的内参引物对和对应的内参探针，所述内参探针标记荧光基团与分别用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因甲基化的探针的荧光基团均不相同。5.如权利要求4所述的用于检测胆管癌的引物探针组合物，其特征在于：所述内参基因为GAPDH、ACTB和RPⅡ中的任一种。6.如权利要求4或5所述的用于检测胆管癌的引物探针组合物，其特征在于：用于检测NGLY1、HOAG1和HOOK1基因甲基化的探针和内参探针的5
’
端标记有FAM、VIC和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟玙沄，陈斌，
申请(专利权)人：广州尔立简生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：