一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用制造技术

一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用，涉及体外检测技术领域；包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ IDNO:1

【技术实现步骤摘要】
一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于体外检测
，具体涉及一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物及试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其病变过程是从宫颈的低级别鳞状上皮内病变，逐渐变化为宫颈的高级别鳞状上皮内病变，进一步就会变成了癌变；宫颈癌的发展周期较长，在宫颈癌早期通过积极的治疗具有较高的生存率，因此，宫颈癌的早期发现、早期诊断、早期治疗具有极大的意义。
[0003]在大多数类型的癌症中基因改变的频率通常很低，在人类所有癌症种类中表观遗传学的改变远远超过体细胞的基因突变，表观遗传学的主要研究内容包括DNA的甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控和染色质结构重构，表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系；其中，DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关，因此DNA甲基化指标检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0004]针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用广泛。
[0005]通过血浆循环游离DNA和宫颈分泌物中脱落细胞以及游离DNA的检测可对宫颈癌进行无创诊断；但是目前还没有效果好的宫颈癌的诊断指标。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，灵敏度高，特异性强，可实现多个目的基因甲基化特异性扩增检测，适用于宫颈癌的筛查和诊断。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其敏感度高、特异性强，对宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和预后评估具有较好效果。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测中的应用。
[0010]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0011]一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；
[0012]用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
[0013]用于检测SOX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
[0014]用于检测PCDH10基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7
‑
8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。
[0015]进一步地，用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的探针的5
’
端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。
[0016]一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。
[0017]进一步地，包括实时荧光定量PCR反应液，所述实时荧光定量PCR反应液包括所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物。
[0018]进一步地，所述实时荧光定量PCR反应液还包括内参GAPDH基因的引物对和探针；所述内参GAPDH基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:10
‑
11所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:12所示。
[0019]进一步地，内参GAPDH基因的探针的5
’
端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB、BHQ淬灭基团的任一种。
[0020]进一步地，还包括裂解液、亚硫酸盐转化试剂和漂洗液。
[0021]一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒在宫颈癌检测中的应用，所述应用中包括以下步骤：
[0022]1)收集样本(样本包括血浆、血清、宫颈分泌液中的任一种)，并从所述样本中提取游离DNA；
[0023]2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化试剂进行甲基化转化，得到bis
‑
DNA；
[0024]3)将所述bis
‑
DNA进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
[0025]进一步地，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度93
‑
97℃处理4
‑
6min，循环1
‑
2次；温度93
‑
97℃处理14
‑
16s，然后温度64
‑
68℃处理28
‑
32s，循环18
‑
22次；温度93
‑
97℃处理9
‑
11s，然后温度60
‑
64℃处理30
‑
32s，采集荧光，循环38
‑
42次。
[0026]进一步地，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：温度95℃处理5min，循环1次；温度95℃处理15s，然后温度66℃处理30s，循环20次；温度95℃处理10s，然后温度62℃处理31s，采集荧光，循环40次。
[0027]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0028]本专利技术的一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，可对PAX1、SOX1和PCDH10基因的甲基化特异性扩增和标记，灵敏度高，特异性强，可应用在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂。
[0029]本专利技术的一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，可以方便快捷地在分子水平上实现对宫颈癌的检测，通过多个靶基因的甲基化联合检测以提高准确度，对宫颈癌的恶性程度和预后判断，具有准确度高、灵活快速和经济节约的优点，可进行无创早期
筛查，有利于宫颈癌的早期发现。
附图说明
[0030]图1为本专利技术实施例3中采用第一实时荧光定量PCR反应液的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH，线2为PAX1。
[0031]图2为本专利技术实施例3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，其特征在于，包括用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的引物对和探针；用于检测PAX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；用于检测SOX1基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；用于检测PCDH10基因甲基化的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7
‑
8所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。2.如权利要求1所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物，其特征在于：用于检测PAX1、SOX1和PCDH10基因甲基化的探针的5
’
端标记有FAM、ROX和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。3.一种权利要求1或2所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物在制备宫颈癌的早期筛查和诊断试剂中的应用。4.一种用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：包括实时荧光定量PCR反应液，所述实时荧光定量PCR反应液包括权利要求1或2所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的引物探针组合物。5.如权利要求4所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应液还包括内参GAPDH基因的引物对和探针；所述内参GAPDH基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:10
‑
11所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:12所示。6.如权利要求5所述的用于宫颈癌的多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于：内参GAPDH基因的探针的5

【专利技术属性】
技术研发人员：钟玙沄，陈斌，
申请(专利权)人：广州尔立简生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：