一种单基因检测方法及其应用技术

本申请涉及一种单基因检测方法及其应用。具体涉及一种基因修饰的检测方法，包含(S1)基于目标基因的临床检验阳性样本和临床检验阴性样本的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定待测区域，(S2)检测待测样本的所述待测区域的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

【技术实现步骤摘要】
一种单基因检测方法及其应用


[0001]本申请涉及生物医学领域，具体的涉及一种单基因检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前，临床上没有有效的方法提前筛选肿瘤患者靶向药治疗真正获益的人群，也没可靠的方法提前对肿瘤转移以及治疗过程中脏器损伤进行预警。常用筛选靶向药治疗获益人群的方法是使用肿瘤患者穿刺或者手术的肿瘤组织样本进行相关靶点基因的免疫组化(IHC)、原位杂交荧光(FISH)等检测，从而判断肿瘤患者是否适合靶向药的治疗。这种检测方法需要肿瘤组织样本，患者等待周期长，同时受到肿瘤异质性以及转移的影响，筛选靶向药获益人群特异性差。DNA羟甲基化是重要的表观遗传修饰形式，作为一种很有前景的生物标志物，与人类多种疾病的发生及发展密切相关，然而针对DNA羟甲基化对特定人群筛选的研究尚未开发。因此急需开发一种方便、快捷、准确的检测方法，提前筛选治疗获益人群以及对肿瘤转移、脏器损伤进行预警。

技术实现思路

[0003]一方面，本申请提供了一种分析方法，包含(S1)基于目标基因的临床检验阳性样本和临床检验阴性样本的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定待测区域，(S2)检测待测样本的所述待测区域的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。
[0004]另一方面，本申请提供了一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，包含(S1)基于目标基因的临床检验阳性样本和临床检验阴性样本的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定待测区域，(S2)检测待测样本的所述待测区域的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。
[0005]另一方面，本申请提供了一种分析方法，包含基于单个目标基因，通过数字PCR的方法检测待测样本的所述单个目标基因的待测区域的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。
[0006]另一方面，本申请提供了一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，包含基于单个目标基因，通过数字PCR的方法检测待测样本的待测区域的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。
[0007]另一方面，本申请提供了一种核酸，所述核酸包含能够结合本申请所述的方法确定的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。
[0008]另一方面，本申请提供了一种制备核酸的方法，包含根据本申请所述的方法确定的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列，设计能够结合所述待测区域、或其互补区域、或上述的片段的核酸。
[0009]另一方面，本申请提供了一种试剂盒，包含本申请所述的核酸。
[0010]另一方面，本申请提供了本申请所述的核酸、和/或本申请所述的试剂盒，在制备疾病检测产品中的应用。
[0011]另一方面，本申请提供了本申请所述的核酸、和/或本申请所述的试剂盒，在制备
确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的产品中的应用。
[0012]另一方面，本申请提供了一种数据库，包含本申请所述的方法确定的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。
[0013]另一方面，本申请提供了一种储存介质，其记载可以运行本申请所述的方法的程序。
[0014]另一方面，本申请提供了一种设备，其包含本申请所述的储存介质。
[0015]另一方面，本申请提供了本申请所述的设备，还包含耦接至所述储存介质的处理器，所述处理器被配置为基于存储在所述储存介质中的程序执行以实现本申请所述的方法。
[0016]本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及专利技术的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
[0017]本申请所涉及的专利技术的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及专利技术的特点和优势。对附图简要说明如下：
[0018]图1显示的是，49例黑色素瘤患者血浆游离DNA 5hmC文库中PD
‑
L1羟甲基化位点(CD274)单基因检测的拷贝数(copies of ng)；其中，PD
‑
L1阳性组(PD
‑
L1+)与PD
‑
L1阴性组(PD
‑
L1
‑
)相比有显著性差异(p<0.01)。
[0019]图2显示的是，56例食管鳞癌患者血浆游离DNA 5hmC文库中EGFR羟甲基化位点单基因检测的拷贝数(copies of ng)；其中，EGFR阳性组(EGFR+)与EGFR阴性组(EGFR
‑
)相比有显著性差异(p<0.01)。
[0020]图3显示的是，36例乳腺癌患者血浆游离DNA 5hmC文库中HER2羟甲基化位点(ERBB2)单基因检测的拷贝数(copies of ng)；其中，HER2阳性组(HER2+)与HER2阴性组(HER2
‑
)相比有显著性差异(p<0.01)。
具体实施方式
[0021]以下由特定的具体实施例说明本申请专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请专利技术的其他优点及效果。
[0022]术语定义
[0023]在本申请中，术语“样品”通常是指涉及材料或材料混合物，通常是液体形式的或其它形式，其中可以包含一个或多个目标分析物。
[0024]在本申请中，术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文可互换使用，通常是指任何形式的测量，包括确定要素是否存在。这些术语都可以包括定量和/定性两方面。评估可以是相对的或绝对的。“评估
……
的存在”可以包括确定某物存在的量，以
及确定其存在与否。
[0025]在本申请中，术语“临床检验样本”、“临床检验阳性样本”和“临床检验阴性样本”通常是指通过临床检验的方法，确定阳性或阴性状态的样本。例如，可以通过公认的临床指南的检测方法，对样本进行检验和确认，得出样本为临床检验阳性或临床检验阴性的结论。例如，本领域常用的临床检验方法可以包括但不限于临床免疫组化检测、临床FISH检测、基因突变检测、基因表达量检测、预测疾病及相关症状发生的基因、肿瘤标志物的血液检测等。
[0026]例如，临床免疫组化检测的简要步骤可以包含将临床组织进行冰冻或石蜡切片，封闭后用抗体孵育并进行染色，拍照并根据信号强弱进行分级，其中信号较强、分级较高的作为临床检验阳性样本；而信号较弱、分级较低的为临床检验阴性样本。
[0027]例如，临床FISH检测的简要步骤可以包含FISH样本的制备，探针的制备，探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析方法，包含(S1)基于目标基因的临床检验阳性样本和临床检验阴性样本的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定待测区域，(S2)检测待测样本的所述待测区域的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。2.一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，包含(S1)基于目标基因的临床检验阳性样本和临床检验阴性样本的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定待测区域，(S2)检测待测样本的所述待测区域的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的方法，基于单个目标基因的所述临床检验阳性样本和所述临床检验阴性样本的所述羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在，确定所述待测区域。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，所述步骤(S1)包含步骤(S1
‑
1)：确定所述目标基因的所述临床检验阳性样本和所述临床检验阴性样本。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，所述临床检验阳性样本和所述临床检验阴性样本通过免疫组化法和/或荧光原位杂交法确定。6.如权利要求5所述的方法，所述免疫组化染色评分根据抗体染色信号的标准判断。7.如权利要求5
‑
6中任一项所述的方法，所述荧光原位杂交法比值根据荧光探针信号的标准计算。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，所述步骤(S1)包含步骤(S1
‑
2)：通过羟甲基化测序方法确定所述临床检验阳性样本和所述临床检验阴性样本在相同区域包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段的数量。9.如权利要求8所述的方法，所述羟甲基化测序方法包含以下步骤：(S1
‑
2a)提取样本中的核酸片段，(S1
‑
2b)标记所述核酸片段中包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段，(S1
‑
2c)富集所述包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段，(S1
‑
2d)对所富集的所述包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段进行测序。10.如权利要求9所述的方法，所述标记包含使所述核酸片段与DNAβ
‑
葡萄糖基转移酶和修饰有化学选择性基团的UDP葡萄糖接触。11.如权利要求10所述的方法，所述有化学选择性基团包含叠氮基。12.如权利要求10
‑
11中任一项所述的方法，所述标记还包含使带有化学选择性基团的所述核酸片段与包含能够与所述化学选择性基团反应的生物素接触。13.如权利要求12所述的方法，所述能够与所述化学选择性基团反应的生物素包含二苯并环辛炔修饰的生物素。14.如权利要求9
‑
13中任一项所述的方法，所述富集包含使带有生物素的所述核酸片段与包含链霉亲和素的磁珠接触。15.如权利要求9
‑
14中任一项所述的方法，所述富集包含通过磁力将带有所述羟甲基胞嘧啶的核酸片段的磁珠分离。16.如权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，所述步骤(S1)包含步骤(S1
‑
3)：确定所述临床检验阳性样本和所述临床检验阴性样本中包含差异化羟甲基胞嘧啶的区域，作为所述待测区域。17.如权利要求16所述的方法，所述差异化羟甲基胞嘧啶的区域包含，所述临床检验阳性样本，相比于所述临床检验阴性样本，在所述区域包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段数量显
著提高和/或显著降低的区域。18.如权利要求16
‑
17中任一项所述的方法，通过确定所述临床检验阳性样本相比...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，陈航宇，许诺，陈龙，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：