一种外泌体来源的ecDNA的建库方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体来源的ecDNA的建库方法。该建库方法包括：外泌体总DNA制备；外泌体线性DNA去除；外泌体ecDNA滚环扩增；滚环扩增产物超声打断；打断产物末端修复及A尾添加、加接头；PCR扩增及产物纯化、测序及数据分析。本发明专利技术采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶联用可以更加高效快速的去除线性DNA，从而最大限度的保证了ecDNA的纯度。另外本发明专利技术采用phi292.0DNA聚合酶进行滚环扩增，该聚合酶可以在42℃条件下持续的进行DNA合成，可有效缩短扩增时间，一般在1～2h内即可完成扩增。一般在1～2h内即可完成扩增。一般在1～2h内即可完成扩增。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体来源的ecDNA的建库方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种外泌体来源ecDNA的建库方法。

技术介绍

[0002]外泌体(exosome)是一种30
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150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞
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融合
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外排”等一系列调控过程而形成。几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。
[0003]ecDNA是近期肿瘤学领域的研究热点，ecDNA指的是从染色体上脱落以环状结构存在的DNA。研究表明ecDNA普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并与肿瘤的发生、发展密切相关。
[0004]目前市场上多数为线性DNA的建库技术与产品，没有专门用于环状DNA建库的产品。现有的DNA建库方法不适合用于ecDNA的建库，存在以下缺点：1、ecDNA提取纯化的纯度较差，存在线性DNA污染；2、线性建库方法导致建库有效数据量低；3、建库周期长。因此，急需一种专门用于ecDNA的环状DNA建库方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种外泌体来源ecDNA的建库方法。主要解决现有技术中的DNA建库方法不适合用于ecDNA的建库，存在ecDNA提取纯化的纯度差、建库有效数据量低、建库周期长的问题。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]一种外泌体来源的ecDNA的建库方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)外泌体总DNA制备；
[0009](2)外泌体线性DNA去除；
[0010](3)外泌体ecDNA滚环扩增；
[0011](4)滚环扩增产物超声打断；
[0012](5)打断产物末端修复及A尾添加、加接头；
[0013](6)PCR扩增及产物纯化、测序及数据分析。
[0014]步骤(1)中外泌体总DNA制备，主要选用市售的微量DNA提取试剂盒。优选地，该试剂盒采用QIAGEN公司的QIAamp UCP DNA Micro Kit(56204)。
[0015]作为优选实施方案，所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性DNA。进一步优选地，采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶的联合应用，联合应用可更加高效快速的消解线性DNA。优选地，单链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的核酸外切酶I(MT0087)，双链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的λ核酸外切酶(MT0086)。在外泌体线性DNA去除的反应体系中，所述核酸外切酶I的浓度为0.8
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1.2U/μL，优选为1U/μL；所述λ核酸外切酶的浓度为0.4
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0.6U/μL，优选为0.5U/μL。
[0016]作为优选实施方案，所述步骤(3)中采用phi29 2.0 DNA聚合酶。该酶在保留了phi29 DNA聚合酶的链置换、连续合成特性(>70kb)的基础上，提高了滚环扩增的反应温度，可以在42℃条件下持续的进行DNA合成，极大的提高了滚环扩增的效率，在1
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2h之内，即可完成扩增。优选地，phi29 2.0 DNA聚合酶主要选用新海基因的phi29 2.0 DNA Polymerase(A3703A)。
[0017]作为优选实施方案，所述步骤(4)中超声打断的超声功率为8
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12W，超声时间为4
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6min。
[0018]作为优选实施方案，所述步骤(5)中末端修复及A尾添加的产物直接进行加接头连接；加接头连接产物采用磁珠法进行纯化。打断产物可在单管内快速实现DNA片段末端补平以及5'端磷酸化和3'端加A尾反应，得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物，且该产物无需纯化，可直接进行接头链接。优选地，产物末端修复及A尾添加试剂主要选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的HieffFast
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Pace End Repair/dA
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Tailing Module快速末端修复/A尾添加模块(12608ES24)，可在四十分钟内完成DNA的末端修复以及A尾的添加。接头连接试剂选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的HieffFast
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Pace DNA Ligation Module快速DNA连接模块(12607ES08)，接头试剂选用HieffComplete Adapter Kit forSet 1(12615ES04)。
[0019]作为优选实施方案，所述步骤(6)中PCR扩增产物采用磁珠法进行纯化，获得构建的文库。文库扩增试剂选用Kapa biosystems的KAPA Library Amplification Kit with Primers(250x50μl reactions)(KK2621)进行。
[0020]作为优选实施方案，所述构建好的文库，经过Illumina NovaSeq 6000测序仪测序，获得原始数据；使用Q30值进行原始数据质控；使用cut adapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads；使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上；然后，使用circle
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map软件鉴定所有样品中的ecDNA。
[0021]本专利技术提供的方法适用于不同体液来源的外泌体样本。作为优选实施方案，所述体液为血浆、尿液或脑脊液。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0023]1)现有的ecDNA建库所需时间一般在2
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3天的时间，本专利技术专利提供的方法可在一天内完成建库，建库的时间更短，操作更加简单，快捷。
[0024]2)因ecDNA在总DNA中的占比较低，如果不将总DNA的线性DNA去除干净，则会在后续的实验中占用较多的有效数据量，干扰ecDNA的检测，本专利技术采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶联用的方法，可以更加高效快速的去除线性DNA，从而最大限度的保证了ecDNA的纯度。
[0025]3)本专利技术试剂采用phi29 2.0 DNA聚合酶进行滚环扩增，传统的phi29 DNA聚合酶是在30℃条件下工作的，而本专利技术采用的phi29 2.0 DNA聚合酶可以在42℃条件下持续的进行DNA合成，可有效缩短扩增时间，一般在1～2h内完成扩增，而传统的phi29 DNA聚合酶的扩增则在一天以上。
附图说明
[0026]图1是本专利技术实施例1中本专利技术方案和常规方案的滚环扩增产物的电泳结果图。
[0027]图2是本专利技术实施例2中本专利技术建库方案和文献建库方案下机的有效数据量汇总示意图。
[0028]图3是本专利技术实施例2中本专利技术建库方案鉴定到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体来源的ecDNA的建库方法，该方法包括以下步骤：(1)外泌体总DNA制备；(2)外泌体线性DNA去除；(3)外泌体ecDNA滚环扩增；(4)滚环扩增产物超声打断；(5)打断产物末端修复及A尾添加、加接头；(6)PCR扩增及产物纯化、测序及数据分析。2.如权利要求1所述的外泌体来源的ecDNA的建库方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性DNA。3.如权利要求2所述的外泌体来源的ecDNA的建库方法，其特征在于：所述核酸外切酶采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶两种酶的联合。4.如权利要求3所述的外泌体来源的ecDNA的建库方法，其特征在于：所述单链核酸外切酶采用核酸外切酶I，所述双链核酸外切酶采用λ核酸外切酶；所述核酸外切酶I在反应体系中的浓度为0.8
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1.2U/μL；所述λ核酸外切酶在反应体系中的浓度为0.4
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0.6U/μL。5.如权利要求1所述的外泌体来源的ecDNA的建库方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用phi292.0 DNA聚合酶。6.如权利要求1所述的外泌体来源的ecDNA的建库方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓楠，马跃，赵小玉，蔡瑶，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：