一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组及试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组及试剂盒和应用。该P2型成套探针引物组由荧光探针和引物对组成；引物对由正向引物和反向引物组成；荧光探针为CHIKV NS1P2，引物对为正向引物F11和反向引物R11，或正向引物F13和反向引物R13。该试剂盒含有P2型成套探针引物组。该应用为采用该试剂盒的检测方法。本发明专利技术以基孔肯雅病毒CHIKV的NS1基因保守序列为目的片段构建标准质粒，建立CHIKV的RT

【技术实现步骤摘要】
一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组及试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组及试剂盒和应用，属于生物


技术介绍

[0002]基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)是一种RNA病毒，属于披膜病毒科甲型病毒属，是导致基孔肯雅热(Chikungunya fever)的病原体。基孔肯雅热经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节痛为主要临床特征。人和灵长类动物是CHIKV的主要宿主，急性期患者、隐性感染者和感染病毒的灵长类动物是该病的主要传染源。该病毒主要分布在非洲、东南亚等地区，近年来在印度洋地区造成大规模流行。我国目前以输入性病例为主，但后续大规模流行的风险不容忽视，迫切需要现场快速检测方法用于监测和预警。
[0003]病原现场快速检测方法的金标准为病原核酸检测技术，主要有变温扩增技术(如PCR技术)、等(恒)温扩增技术(如日本学者专利技术的LAMP扩增技术)、基因芯片技术三大类。其中等温扩增技术是在病原核酸的现场快速检测中最有优势。目前主要的恒温扩增技术有：环介导等温扩增(LAMP)、切口内切酶恒温扩增技术(NEAR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、解链酶扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和酶促重组恒温扩增技术(ERA)，这些技术各有特点。
[0004]逆转录酶促重组等温扩增(Reverse Transcription Enzymatic Recombinase Amplification，RT
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ERA)，是中国苏州先达基因科技有限公司开发的等温扩增技术，利用来源于细菌、病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，在低温条件下(25℃
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42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度37℃
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42℃时，扩增反应时间可在15分钟内，与日本荣研公司的LAMP技术，英国TwistDx公司的RPA技术，以及目前广泛使用的荧光定量PCR技术相比，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破。
[0005]目前，针对基孔肯雅病毒的实验室检测常用方法主要有病毒分离、血清学抗体检测、抗原检测、分子生物学检测含基因芯片、RT
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PCR以及宏基因组测序等。然而，目前尚未出现利用ERA恒温扩增技术快速检测基孔肯雅病毒的技术手段。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组，以基孔肯雅病毒CHIKV的NS1基因保守序列作为靶基因，能用于RT
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ERA法检测基孔肯雅病毒；本专利技术还提供相应试剂盒，可准确、快速、有效检测基孔肯雅病毒CHIKV；同时还提供相应的应用，即采用上述试剂盒的非诊断目的检测方法。
[0007]本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：
[0008]一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组，其特征是，所述P2型成套探针引物组由荧光探针和引物对组成，所述引物对由正向引物和反向引物组成；所
述荧光探针为CHIKV NS1 P2；所述引物对由正向引物F11和反向引物R11组成，或由正向引物F13和反向引物R13组成；
[0009]所述荧光探针CHIKV NS1 P2的序列为在SEQ ID NO:1中将第31位碱基标记荧光基团、将第32位碱基替换为四氢呋喃、将第33位碱基标记淬灭基团、并在3`端加入阻断基团；
[0010]正向引物F11的序列为SEQ ID NO:2，反向引物R11的序列为SEQ ID NO:4；正向引物F13的序列为SEQ ID NO:3，反向引物R13的序列为SEQ ID NO:5。
[0011]采用该P2型成套探针引物组后，即能以RT
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ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
[0012]优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，所述阻断基团为C3
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spacer。
[0013]优选地，所述P2型成套探针引物组针对的靶基因是基孔肯雅病毒的NS1基因保守序列，如SEQ ID NO:6所示。
[0014]采用以上优选方案，能更好地实现以RT
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ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
[0015]本专利技术还提供：
[0016]一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：含有前文所述P2型成套探针引物组的探针引物混合液。
[0017]优选地，在探针引物混合液中，P2型成套探针引物组的荧光探针、正向引物、反向引物的摩尔比为1:3.5:3.5。
[0018]优选地，所述试剂盒还包括RT
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荧光扩增试剂、溶解剂、激活剂、超纯水、以及CHIKV阳性对照品。
[0019]优选地，所述CHIKV阳性对照品的制备过程如下：
[0020]构建含有CHIKV NS1基因保守序列的质粒，经体外转录反应获得NS1基因的RNA片段，纯化后即得到CHIKV阳性对照品；所述CHIKV NS1基因保守序列如SEQ ID NO:6所示。
[0021]优选地，所述RT
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荧光扩增试剂和溶解剂均由市售的基础通用型RT
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ERA法试剂盒提供；所述激活剂为280mM乙酸镁溶液；所述CHIKV阳性对照品的浓度为10ng/μl。
[0022]采用上述试剂盒，可有效实现以RT
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ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
[0023]本专利技术还提供：
[0024]一种非诊断目的基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测方法，其特征是，采用前文所述试剂盒；所述检测方法为RT
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ERA检测法，包括以下步骤：
[0025]第一步、将反应管分为样本组和阳性对照组；向各反应管中加入试剂盒的溶解剂、探针引物混合液以及超纯水，获得混合反应液；
[0026]第二步、将混合反应液转移至RT
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荧光扩增试剂中，震荡混匀直到RT
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荧光扩增试剂重悬，离心；
[0027]第三步、向样本组的反应管中加入待测核酸样品，混匀后离心；向阳性对照组的反应管中加入CHIKV阳性对照品，混匀后离心；
[0028]第四步、在反应管盖上加入激活剂，盖紧管盖，通过离心使激活剂进入管内液体中，震荡混匀并再次离心；
[0029]第五步、将反应管置于荧光恒温扩增仪中进行RT
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ERA扩增，并采集荧光值；
[0030]第六步、反应结束，保存数据；根据阳性对照组的时间
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荧光值曲线，判断本次检测是否有效；若本次检测有效，则根据样本组的时间
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荧光值曲线，判断待测核酸样品是否含有基孔肯雅病毒。
[0031]优选地，第五步中，在RT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组，其特征是，所述P2型成套探针引物组由荧光探针和引物对组成，所述引物对由正向引物和反向引物组成；所述荧光探针为CHIKV NS1 P2；所述引物对由正向引物F11和反向引物R11组成，或由正向引物F13和反向引物R13组成；所述荧光探针CHIKV NS1 P2的序列为在SEQ ID NO:1中将第31位碱基标记荧光基团、将第32位碱基替换为四氢呋喃、将第33位碱基标记淬灭基团、并在3`端加入阻断基团；正向引物F11的序列为SEQ ID NO:2，反向引物R11的序列为SEQ ID NO:4；正向引物F13的序列为SEQ ID NO:3，反向引物R13的序列为SEQ ID NO:5。2.根据权利要求1所述基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组，其特征是，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，所述阻断基团为C3
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spacer。3.根据权利要求2所述基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组，其特征是，所述P2型成套探针引物组针对的靶基因是基孔肯雅病毒的NS1基因保守序列，如SEQ ID NO:6所示。4.一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：含有权利要求1至3任一项所述P2型成套探针引物组的探针引物混合液。5.根据权利要求4所述基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，在探针引物混合液中，P2型成套探针引物组的荧光探针、正向引物、反向引物的摩尔比为1:3.5:3.5。6.根据权利要求5所述基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括RT
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荧光扩增试剂、溶解剂、激活剂、超纯水、以及CHIKV阳性对照品。7.根据权利要求6所述基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，所述CHIKV阳性对照品的制备过程如下：构建含有CHIKV NS1基因保守序列的质粒，经...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗正汉，张锦海，韩一芳，叶福强，胡丹，王太武，陈乐如，曹勇平，蒯月璋，汪春晖，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：