【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及用于恙虫病东方体的crispr-cas12a检测特异性靶标序列、引物组及其应用，更加具体的涉及用于恙虫病东方体检测的靶标序列和crispr-cas12a检测用引物、crrna及其用途。
技术介绍
1、恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi，ot)属于东方体属，是一种自然疫源性病原体，主要通过恙螨幼虫叮咬传播，可导致恙虫病，是一种人畜共患病。恙虫病主要流行于东南亚、西南太平洋岛屿和日本，国内主要见于东南和西南地区，我国目前22个省区均有该病的发生和流行，疫区不断扩大是当前我国恙虫病疫情的流行趋势。恙虫病东方体的主要媒介昆虫为恙螨，啮齿动物尤其是鼠类是其主要传染源，恙虫病东方体可长期在鼠类体内保存，故感染恙虫病的鼠类具有较长的传染期。恙虫病已经成为我国重要的鼠源性自然疫源性疾病，对人类健康构成极大威胁。感染后有4-21日的潜伏期，后可突然起病，主要表现为高热、颜面潮红、焦痴、溃疡、皮疹、浅表淋巴结肿大等症状。恙虫病东方体感染后，需及时治疗，未经有效治疗者病死率高达40％。经典的恙虫病东方体检测方法，包括分离培养、血清学检查、pcr技术、全基因组和宏基因组测序等，这些方法虽然在检测恙虫病东方体方面起着重要作用，但同时具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。因此，无论是预防还是治疗，都需要开发一种快速、灵敏和特异的方法来检测恙虫病东方体。
2、crispr-cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重
3、重组酶聚合酶恒温扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。其在国内基于开发的公司及使用酶来源等的差异，又被命名为重组酶介导等温扩增技术(recombinase aidedamplification，raa，江苏奇天基因生物科技有限公司、杭州众测生物科技有限公司)或酶促恒温扩增技术(enzymatic recombinase amplification，era，苏州先达基因科技有限公司)等。raa用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(pcr)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，raa省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。raa技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。
4、将crispr-cas12a检测系统与raa技术结合，通过raa技术常温扩增目的片段，然后进行crispr-cas12a检测反应，此结合的意义在于raa预先扩增可以弥补crispr-cas12a检测灵敏度不高的缺陷，同时利用crispr-cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性，达到优势互补，提高检测效果的目的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于恙虫病东方体核酸检测的特异性靶标序列以及靶向该序列的crispr检测引物和crrna，将此引物组及crrna用于基于crispr技术的基因检测中可快速现场检测恙虫病东方体，具有特异性好，灵敏度高，简易的优点。
2、第一方面，本专利技术提供了一种用于检测恙虫病东方体核酸的靶标序列；
3、所述恙虫病东方体的靶标序列为恙虫病东方体的seq id no.1所示的tppb基因。
4、第二方面，本专利技术提供了一种用于检测恙虫病东方体的靶向上述特异性靶标序列的crispr-cas12a系统，包括cas12a蛋白和crrna，或二者形成的复合体；
5、所述crrna包括用于与cas12a蛋白结合的锚定序列和靶向恙虫病东方体靶标序列的向导序列；
6、上文所述crispr-cas12a系统中，所述crrna中，所述锚定序列可为seq id no.26的第1-21位，所述向导序列可为seq id no.26的第22-43位。具体地，所述crrna的序列为seq id no.26；
7、或，所述cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。
8、第三方面，本专利技术提供了一种用于检测恙虫病东方体的试剂盒，其包括如下：
9、1)第二方面中所述用于检测恙虫病东方体的crispr-cas12a系统；
10、2)用于特异性扩增第一方面中所述恙虫病东方体靶点序列的raa扩增引物；
11、3)作为荧光报告分子的探针；
12、所述探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。
13、上文所述试剂盒中，所述raa引物对为能够以恙虫病东方体基因组为模板扩增得到seq id no.1的第1-171位所示dna片段的引物对。
14、所述raa扩增引物由seq id no.2所示的单链dna分子和seq id no.5所示的单链dna分子组成；
15、在本专利技术的具体实施方式中，所述探针的荧光报告基团具体为fam，荧光淬灭基团具体为bhq1。所述探针为：5`6-fam-tttttttttttt-bhq1-3’。
16、进一步地，所述试剂盒还可含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合酶、链置换型dna聚合酶、dntps和醋酸镁。
17、进一步地，所述试剂盒还可含有阳性参考质粒。
18、更进一步地，所述阳性参考质粒可为含有seq id no.1的第1-171位所示dna片段的质粒，具体为将seq id no.1的第1-171位所示dna片段克隆到puc57载体后得到的重组质粒。
19、第四方面，本专利技术提供了如下任一物质：
20、a1)第一方面中的所述的靶标序列；
21、a2)第二方面中的所述的crrna；
22、a3)第二方面中的所述的cas12a蛋白和crrna，或者二者形成的复合体；
23、a4)第三方面中的所述的raa扩增引物；
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【技术保护点】
1.一种用于检测恙虫病东方体的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，包括Cas12a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，所述恙虫病东方体的靶点序列为SEQ ID No.26第22-43位所示RNA片段的编码DNA。
3.根据权利要求2所述的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，所述crRNA的序列为SEQ IDNo.26；或，所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。
4.一种用于检测恙虫病东方体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
6.权利要求1-3任一中所述的crRNA、Cas12a蛋白和crRNA的组合物，或者Cas12a蛋白和crRNA形成的复合体。
7.权利要求4或5中所述的RAA扩增引物。
8.权利要求4或5中所述的探针。
9.如下任一应用：
10.一种检测或辅助检测恙虫病东方体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种用于检测恙虫病东方体的crispr-cas12a系统，其特征在于，包括cas12a蛋白和crrna，或二者形成的复合体；
2.根据权利要求1所述的crispr-cas12a系统，其特征在于，所述恙虫病东方体的靶点序列为seq id no.26第22-43位所示rna片段的编码dna。
3.根据权利要求2所述的crispr-cas12a系统，其特征在于，所述crrna的序列为seq idno.26；或，所述cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。
...【专利技术属性】
技术研发人员：齐永，李越希，毛颖清，操敏，王俊虎，李文豪，陆年宏，卢永锋，易海明，陈超，郭伟，葛艺欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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