【技术实现步骤摘要】
一种野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒及其构建方法和应用
[0001]本专利技术涉及生物
,具体地,涉及一种野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
[0002]鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)是水禽的一种急性、高热性传染病,其能够使水禽产蛋量急剧下降,感染鸭坦布苏病毒的水禽死亡率可达30%,该病毒已经成为危害养禽业的重要传染病之一。
[0003]鸭坦布苏病毒具有广泛的天然宿主,包括蚊子、鸭、鸡、鹅、鸽子和麻雀等。种鸭、蛋鸭和种鹅在感染鸭坦布苏病毒之后,主要表现为采食量下降,拉绿色稀粪、产蛋量急剧下降等临床特征;感染后期神经症状明显,表现为共济失调,头颈抽搐,翅膀麻痹,步态不稳甚至瘫痪,而感染病毒耐受后的禽类产蛋性能也会发生下降,一般无法恢复到正常水平。并且鸭坦布苏病毒除了具有广泛的禽类宿主之外,还能够感染哺乳动物,感染鸭坦布苏病毒的小鼠会表现出严重的神经症状甚至死亡。
[0004]鸭坦布苏病毒是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒,有帽子结构,无poly(A)尾,基因组全长约11000bp,包含5
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和3
’
非编码区以及一个长的开放性阅读框,该开放性阅读框编码三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白前体蛋白prM和囊膜蛋白E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。
[0005]相比于其他单股正链RNA病毒,构建黄病毒的全长cD ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒,其特征在于,所述野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1.pBR322载体的改造:以pBR322载体质粒为模板,使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的片段;利用NheI和SalI内切酶分别双酶切pBR322载体质粒以及核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的片段,并利用T4 DNA连接酶连接,得到核苷酸序列如SEQ ID NO:10的重组载体;S2.野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒的构建:以pcDNA3.1载体质粒为模板,用核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物扩增得到A1片段;以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA作为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示引物扩增得到A2片段;以A1和A2片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示引物扩增得到A片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示引物扩增得到B片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示引物扩增得到C1片段;以C1片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示引物扩增得到C2片段;以C2片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20所示引物扩增得到C片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示引物扩增得到D片段,以核苷酸序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示引物扩增得到E片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示引物扩增得到F1片段,以核苷酸序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示引物扩增得到F2片段;以F1和F2片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28所示引物扩增得到F片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示引物扩增得到G片段;以野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示引物扩增得到H1片段;以pcDNA3.1载体质粒为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示引物扩增得到H2片段;以H2片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示引物扩增得到H3片段;以H3片段为扩增模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36所示引物扩增得到H4片段;以H1片段和H4片段为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34所示引物扩增得到H片段;使用Pac I和Sma I双酶切片段D和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的重组载体,并利用T4 DNA连接酶连接,得到重组质粒pB
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S132
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D;使用Xho I和SnaB I双酶切片段C和重组质粒pB
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S132
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D,并利用T4 DNA连接酶连接,得到重组质粒pB
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S132
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CD;使用PmII和StuI双酶切片段E和重组质粒pB
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S132
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CD,并利用T4 DNA连接酶连接,得到重组质粒pB
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S132
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CDE;使用StuI和SbfI双酶切片段F和重组质粒pB
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S132
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CDE,并利用T4 DNA连接酶连接,得到重组
质粒pB
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S132
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CDEF;使用Sbf I和Pme I进行双酶切片段G和重组质粒pB
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S132
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CDEF,并利用T4 DNA连接酶连接,得到重组质粒pB
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S132
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CDE...
【专利技术属性】
技术研发人员:焦培荣,丁仰保,黄展鸿,袁世超,
申请(专利权)人:岭南现代农业科学与技术广东省实验室,
类型:发明
国别省市:
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