一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的特异性PCR引物对及其检测方法。所述正向引物序列为：5

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物序列及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的特异性引物对及其检测应用方法。

技术介绍

[0002]小菜蛾(Plutella xylostella)属鳞翅目菜蛾科，俗称两头尖、吊死鬼等，主要为害十字花科蔬菜作物。1910年在我国台湾地区首次报道发现小菜蛾，目前已广泛分布于世界各地，是鳞翅目昆虫中分布最为广泛的害虫之一(Talekar,N.S.&Shelton,A.M.Biology,ecology,and management of the diamondback moth.Annual Review of Entomology,1993,38:275
–
301)。我国南方各省份是十字花科蔬菜和油料作物主产区，小菜蛾则主要在这些地区发生危害。90年代以来，小菜蛾在我国北方地区的危害程度也呈现显著上升趋势，为田间防控带来了巨大压力(张友军,吴青君,王少丽,褚栋,谢文.我国蔬菜重要害虫研究现状与展望.植物保护,2013,39:38
–
45)。小菜蛾主要以幼虫取食寄主植物叶片，田间暴发严重时，可造成蔬菜减产90％以上，甚至绝收。全球每年因小菜蛾危害造成的经济损失高达40
‑
50亿美元(Furlong,M.J.,Wright,D.J.&Dosdall,L.M.Diamondback moth ecology and management:problems,progress,and prospects.Annual Review of Entomology,2013,58:517
–
541)，我国每年小菜蛾危害造成的经济损失也可高达7.7以美元(Li,Z.,Feng,X.,Liu,S.S.,You,M.,Furlong,M.J.Biology,ecology,and management of the diamondback moth in China.Annual Review of Entomology,2016,61:277
–
296)。小菜蛾极易对各类杀虫剂产生抗性，且对杀虫剂的抗性发展速度极快，抗性水平高，田间化学防治十分困难(吴青君,张文吉,朱国仁.小菜蛾的发生为害特点及抗药性现状.中国蔬菜,2001:49
–
51)。
[0003]苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)属革兰氏阳性细菌，在产孢和营养生殖阶段形成多种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs)，可以特异性地杀死多种农业、林业及卫生害虫，且对非靶标生物无害。基于Bt杀虫蛋白开发的生物杀虫剂及转Bt基因抗虫作物已在全世界广泛应用，据报道，Bt生物杀虫剂占全球微生物杀虫剂总量的95％，占整个杀虫剂市场的2％左右(Bravo,A.,Likitvivatanavong,S.,Gill,S.S.,Sober
ó
n,M.Bacillus thuringiensis:A story of a successful bioinsecticide.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2011,41:423
–
431)。作为化学杀虫剂的良好替代品，Bt生物技术产品在害虫防治、化学农药减施以及环境保护等方面发挥着极其重要的作用。然而，这些Bt生物技术产品与化学杀虫剂一样也面临着害虫抗药性进化的严重威胁。目前，全世界已有包括小菜蛾在内的9种重大农业害虫在田间对Bt产生了高抗性。害虫Bt抗性的发展严重破坏了Bt生物技术产品的应用前景，因此，在田间建立早期害虫Bt抗性监测预警体系，对延缓Bt抗性发展具有重要意义。传统毒力生物测定的检测方法费时费力，且检测结果并不能完全准确判断种群抗性发展情况。而在田间抗性监测过程中，往往需要检测方法更为快速、简便和精准。
[0004]转座子是一类可以在宿主基因组上进行跳跃并完成转录或者逆转录的DNA序列(Wells,J.N.&Feschotte,C.Afield guide to eukaryotic transposable elements.Annual Review of Genetics,2020,54:539
–
561)。根据其转座方式可以分为逆转座子和DNA转座子。其中逆转座子又可分为长末端重复(LTR)逆转座子、长散在核元件(LINE)逆转座子和短散在核元件(SINE)逆转座子。转座子是生物基因组的重要组成部分，据报道，玉米基因组85％由转座子组成。转座子一方面可通过促进基因组序列的易位、外显子的改变和双链断裂的修复来驱动基因组的进化，另一方面发生转座或者插入后可以作为启动子、增强子、抑制子或者绝缘子调节附近基因的表达，从而改变基因调控方式和宿主最终表型，是生物进化的关键遗传来源(Chuong,E.B.,Elde,N.C.&Feschotte,C.Regulatory activities of transposable elements:from conflicts to benefits.Nature Reviews Genetics,2017,18:71
–
86)。研究表明，转座子与害虫抗药性进化密切相关(Rostant,W.G.,Wedell,N.&Hosken,D.J.Transposable elements and insecticide resistance.Advances in Genetics,2012,78:169
–
201)，是检测害虫对杀虫剂是否产生抗性的重要遗传标记。在利用遗传标记进行抗性鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。

技术实现思路

[0005]研究发现，位于小菜蛾BtR
‑
1抗性基因座内的MAPK信号途径可以作为通用分子开关，反式调控下游多个Bt杀虫蛋白Cry1Ac中肠受体基因表达量的变化，从而使小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生高抗性(Guo,Z.et al.MAPK signaling pathway alters expression of midgut ALP and ABCC genes and causes resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin in diamondback moth.PLoS Genetics,2015,11:e1005124；Guo,Z.et al.MAPK
‑
dependent hormonal signaling plasticity contributes to overcoming Bacillus thuringiensis toxin acti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的特异性PCR引物对，其上游引物核苷酸序列为：5
′‑
AATTCAACGCGTTCGCAAGT
‑3′
，其下游引物核苷酸序列为：5
′‑
GGAGTACCTACTGCATAGCT
‑3′
。2.如权利要求1所述的引物序列在检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac杀虫蛋白抗性中的应用。3.如权利要求2所述的引物序列在检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac杀虫蛋白抗性中的应用，其特征在于：所述应用为：以待测小菜蛾4龄幼虫基因组DNA样本为模板，以权利要求1所述引物进行PCR扩增，若扩增产物大小为507 bp的单一条带，则待测小菜蛾为Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性样本，若扩增产物大小为241 bp的单一条带或同时出现507 bp和241 bp的杂合条带，则待测小菜蛾为Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感样本。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所检测到的507 bp扩增产物中包含一个逆转座子SE2。5.如权利要求3所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭兆将，郭乐，朱流红，白杨，叶凡，程周强，董丽娜，张友军，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：