鲫鲤杂交子一代Caspase-6等位基因表达检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了鲫鲤杂交子一代Caspase

【技术实现步骤摘要】
鲫鲤杂交子一代Caspase
‑
6等位基因表达检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及鲫鲤杂交子一代凋亡相关基因Caspase
‑
6等位基因表达的检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]细胞凋亡是细胞的基本生物学现象，是生物进化，内部环境稳定和多种系统发展的重要组成部分。通过激活保守的凋亡信号通路，分化后受损的细胞或不必要的细胞在胚胎发育，组织重塑和免疫调节过程中得以消除。caspase蛋白家族在这些凋亡途径中起着重要作用。其中，凋亡执行者之一Caspase
‑
6可以直接作用于特定的底物以完成凋亡反应。Caspase
‑
6作为参与凋亡反应的胱天蛋白酶家族的重要成员，在鱼类中很少报道。红鲫(Carassius auratus red var.)和鲤(Cyprinus carpio)是重要的淡水经济鱼，通过收集杂交鲫鲤F1的胚胎研究Caspase
‑
6在F1的胚胎发育过程中的作用，揭示了F1中较低的繁殖力与凋亡通路中关键基因的表达有着密切的关系。
[0003]杂种优势(Heterosis)是指杂交后代通过继承来自父母本的优良遗传物质，可能得到一个优于父母本的生物特性。这样的情况往往适用于植物杂交，动物中，特别是低等脊椎动物中，杂交子一代在胚胎发育过程中，伴随着细胞的凋亡与进化，F1群体部分可育，生殖力有所下降，有研究证明，胱天蛋白酶6促进编程的细胞死亡途径的激活。因此，关键基因的表达调控作用是导致鱼类部分可育的关键机制。在杂交子代中，基因组选择性表达是杂交组合中杂种优势产生机制的关键机制之一。一种杂交三倍体Squalius alburnoides中，多个基因出现等位沉默，且在不同的组织中，等位沉默比例有所不同。在亚马逊鳉鱼中(Poecilia formosa)，雄激素受体α在卵巢中有明显的偏性表达，而在脑和鳃中则没有双亲基因组选择性表达差异。剑尾鱼属(Xiphophorus)的杂交和回交研究中，等位基因表达与其体色有关。因此，在杂交鱼中，等位基因表达参与杂种优势表现。但是，等位基因表达由于技术上的瓶颈，在养殖杂交鱼类中的研究方法还有待开发。
[0004]杂交鲫鲤F1是由红鲫(Carassius auratus red var.,
♀
,缩写为RCC)和鲤(Cyprinus carpio,
♂
,缩写为CC)通过远缘杂交技术获得的新品种。目前包括三个可育杂交群体，鲫鲤杂交获得的可稳定遗传的品系已经在中国南方被广泛养殖。杂交鲫鲤F1由于突破生殖难关，为远缘杂交突破生殖隔离提供了宝贵材料。因此也可以作为研究杂交后新种形成的研究模型。阐明等位基因表达将为探讨杂种优势的形成机制提供新的窗口。通过研究鲫鲤杂交鱼亲本红鲫和鲤的Caspase
‑
6序列，并研发等位基因表达检测方法及其试剂盒，不仅能了解Caspase
‑
6在鲫鲤F1胚胎发育过程中的作用，而且对今后在杂交鱼育种的等位基因研究以及开发分子标记有意义。
[0005]传统的等位基因表达检测的常用方法主要是基于亲本间丰富的SNPs和InDels变化位点。主要方法包括有等位基因特异聚合酶链式反应(Allele
‑
specific PCR，AS
‑
PCR)和TaqMan技术。AS
‑
PCR是根据SNP或InDels变异位点设计的3
’
末端与这些差异位点互补或错
配的特异PCR引物，并能够通过琼脂糖凝胶电泳分别是否有目的条带鉴定等位基因表达的方法，其技术实现方案包括：1.针对关键差异位点设计引物，且一端引物必须在3
’
末端以保证序列的互补或错配；2.通过PCR扩增获得正常扩增产物；3.通过琼脂糖凝胶电泳检测等位基因表达情。TaqMan技术通过一条TaqMan探针(由FAM
TM
或染料标记，其3'端结合了小沟结合物与非荧光性淬灭基团)，通过探针的荧光发光亮度检测等位基因表达。其技术实现方案包括：1.设计TaqMan扩增引物和TaqMan探针；2.在实时定量PCR仪上进行扩增，并采用机器获得荧光值，并采用基因组DNA的两条allele作为1:1的校正内参；3.根据荧光值计算差异位点表达比例。这两种方法存在的缺陷是1.TaqMan检测法成本高，该方法依赖于荧光定量PCR，其中的荧光定量试剂价格较高；2.AS
‑
PCR需要琼脂糖凝胶电泳检测，操作繁琐，检测效率低，耗时耗力。
[0006]因此，研究更合适的焦磷酸测序技术分析鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因检测方法及其试剂盒，将对提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，针对目前TaqMan检测法成本高和AS
‑
PCR检测效率低的问题，本专利技术采用焦磷酸测序的方法研发了一套操作简洁、成本低的鲫鲤F1Caspase
‑
6等位基因表达技术。
[0008]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0009]一种检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的引物为：
[0010]Caspase
‑6‑
F：5
’‑
AGATGGACCACAAGAAACGAGG
‑3’
；
[0011]Caspase
‑6‑
BR：5
’‑
CATAAGCCTTCACTTCAAATCCC
‑3’
。
[0012]本专利技术的引物在制备杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达检测试剂中的应用。
[0013]一种用于检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的试剂盒，包含括Caspase
‑6‑
F和Caspase
‑6‑
BR引物。
[0014]用于检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的试剂盒，其特征在于，包括：cDNA 0.8μL，耐热Taq酶1μL，dNTP 50μmol/L 2μL，正向引物10nM 0.5μL，反向引物10nM 0.5μL，无菌水15.2μL。
[0015]检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的方法，包括如下步骤：
[0016](1)RNA逆转录：取鲫鲤F1鱼胚胎，提取胚胎的RNA，将提取的RNA逆转录为模板cDNA；
[0017](2)PCR扩增：以步骤(1)得到的cDNA为模板，以Caspase
‑6‑
F，Caspase
‑6‑
BR为特异性引物进行PCR扩增反应，得到待测核酸片段；
[0018]所述正向引物序列Caspase
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的引物，其特征在于，引物为，Caspase
‑6‑
F：5
’‑
AGATGGACCACAAGAAACGAGG
‑3’
；Caspase
‑6‑
BR：5
’‑
CATAAGCCTTCACTTCAAATCCC
‑3’
。2.一种如权利要求1所述的引物在制备杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达检测试剂中的应用。3.一种用于检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的试剂盒，其特征在于，包含括权利要求1所述的引物。4.根据权利要求3所述的用于检测杂交鲫鲤F1 Caspase
‑
6等位基因表达的试剂盒，其特征在于，包括：cDNA 0.8μL，耐热Taq酶1μL，dNTP 50μmol/L 2μL，正向引物10nM 0.5μL，反向引物10nM 0.5μL，无菌水15.2μL。5.一种利用权利要求1所述引物检测杂交鲫鲤F1 Caspase
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6等位基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)RNA逆转录：取鲫鲤F1组织样品，提取RNA，将提取的RNA逆转录为模板cDNA；(2)PCR扩增：以步骤(1)得到的cDNA为模板，以Caspase
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少军，周毅，王姣姣，钟欢，陶敏，张纯，周钰玲，戴韬，张怡，秦伟玲，皮佳敏，刘慧，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：