一种慢病毒整合位点的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种慢病毒整合位点的检测方法及其应用，其中，检测方法包括如下的步骤：S100.提取DNA，打断；S200.对打断的DNA进行末端修复和加A，采用接头引物扩增，连接不对称接头；S300.以步骤S200的PCR产物作为模板，采用第一轮引物、引入blocker进行扩增；S400.以步骤S300的PCR产物作为模板，采用第二轮引物、引入blocker进行扩增；同时引入测序平台的测序引物结合序列；S500.对步骤S400的PCR产物上机测序；S600.过滤测序数据；S700.根据过滤后的数据判别慢病毒整合事件。本发明专利技术以接头介导的PCR技术为基础，通过两步PCR富集插入位点，与其他建库方法相比，操作简单、实验周期短且成本低廉。同时通过引入靶向前病毒序列的blocker，阻断5

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒整合位点的检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因治疗和细胞治疗药物开发领域。具体地，涉及一种慢病毒整合位点的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]慢病毒是逆转录病毒中的一类，现有的慢病毒载体来源于多个物种，包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)等。它是以慢病毒基因组为基础，去除其表达非必需的基因，代之以治疗基因构建而成的。慢病毒整合到宿主细胞的染色体上可以长期稳定表达，并且与其他逆转录病毒(例如腺病毒)相比，慢病毒不但能感染分裂期细胞，而且还能感染非分裂期的细胞，基于以上优点，慢病毒载体(lentiviral vector)作为外源基因转移载体已广泛用于临床基因治疗。
[0003]以慢病毒作为载体的明显优点是基因转移效率高，整合率也明显高于其他基因转移方法。然而，由于整合位点是决定外源基因表达水平的因素之一，目前慢病毒载体尚不能将目的基因插入到特定位点而是随机插入，因此慢病毒载体介导的基因转导的可能风险之一是其可能整合到宿主细胞的原癌基因或抑癌基因内引发插入性诱变(insertionalmutagenesis)，导致癌基因的激活或抑癌基因的抑制，从而诱导癌症的发生。这些潜在的副作用已经引起人们的极大关注，所以我们需要对慢病毒载体介导的基因转移的安全性进行评价。
[0004]对慢病毒随机插入的评估方法随着基因/细胞治疗的应用发展而发展。以往的研究中，人们最早利用Southern杂交和前病毒PCR的方法进行病毒插入位点的鉴定，该方法的问题是灵敏度和特异性不够。随之，线性扩增介导的PCR(Linear Amplification
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Mediated PCR,LAM
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PCR)的发现是病毒插入位点的重大进步，现有的病毒插入位点分析(VIS)多基于该方法。LAM
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PCR可用于检测复杂样品如来源于外周血的罕见的插入位点，但该方法需要考虑到限制性内切酶的切割识别频率的偏好性，存在技术误差的风险。随着测序技术的发展，LAM
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PCR与高通量测序技术结合，成为插入位点鉴定的有效方法，利用生物素标记已知区域，富集插入位点进而分析整合安全性和偏好性。但LAM
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PCR依赖线性扩增技术，扩增时间长，下游生物素捕获流程复杂，导致实验周期长且操作容易出错。同时生物素标记引物，也增加了合成成本与工作时间。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是建立高灵敏度慢病毒插入位点检测方法，与其他建库方法相比，操作简单、实验周期短且成本低廉。
[0006]本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]一种慢病毒整合位点的检测方法，包括如下的步骤：
[0008]S100.提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断为200～400bp的片段；
[0009]S200.对打断的宿主基因组DNA进行末端修复和加A，连接不对称接头；
[0010]S300.以步骤S200的PCR产物作为模板，采用第一轮引物、引入blocker进行扩增，第一次富集整合DNA；
[0011]S400.以步骤S300的PCR产物作为模板，采用第二轮引物、引入blocker进行扩增，第二次富集整合DNA；同时引入测序平台的测序引物结合序列；
[0012]S500.对步骤S400的PCR产物上机测序；
[0013]S600.过滤测序数据；
[0014]S700.根据过滤后的数据判别慢病毒整合事件。
[0015]本专利技术以接头介导的PCR(Ligation
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Mediated PCR，LM
‑
PCR)技术为基础，通过两步PCR富集插入位点，与其他建库方法相比，操作简单、实验周期短且成本低廉。同时通过引入靶向前病毒序列(provirus)的特异性探针(blocker)，阻断5
’
LTR无效整合位点reads的扩增，提高检测的灵敏度。
[0016]作为优选，所述接头引物为：上游引物AdaptorF，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物AdaptorR，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0017]作为优选，所述blocker的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0018]作为优选，步骤S300中的第一轮引物和S400中的第二轮引物采用巢式引物。
[0019]作为优选，所述第一轮引物为：LTRF1，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；ADR1，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0020]作为优选，所述第二轮引物为：上游引物的核心序列的核苷酸序列为“5
’‑
GTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTA
‑3’”
，如SEQ ID NO：6所示；下游引物的核心序列的核苷酸序列为“5
’‑
TACCGGACCGAAGGAGCTAA
‑3’”
，如SEQ ID NO：7所示。
[0021]作为优选，第二轮引物，上游引物在对应的核心序列的5
’
端加上P5引物序列、P5端index序列和测序引物序列，下游引物在对应的核心序列的5
’
端加上P7引物序列、P7端index序列和测序引物序列。
[0022]进一步地优选，第二轮引物，上游引物为LTRFneststepi501、LTRFneststepi502、LTRFneststepi503、LTRFneststepi504、LTRFneststepi505、LTRFneststepi506、LTRFneststepi507、LTRFneststepi508中的任一条，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：8
‑
15所示；下游引物的为ADR2
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2step(p51)、ADR2
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2step(p52)、ADR2
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2step(p53)、ADR2
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2step(p54)、ADR2
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2step(p55)、ADR2
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2step(p56)、ADR2
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2step(p57)、ADR2
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2step(p58)、ADR2
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2step(p59)、ADR2
‑
2step(p60)、ADR2
‑
2step(p61)、ADR2
‑
2step(p62)中的任一条，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：16
‑
27所示。其中上游引物和下游引物各包含8碱基的标记序列，通过不同的上游下游引物组合(最多96种)，样品可标记上不同标签，最多支持96种样品同时建库和上机。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，包括如下的步骤：S100. 提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断为200~400 bp的片段；S200. 对打断的宿主基因组DNA进行末端修复和加A，连接不对称接头；S300. 以步骤S200的PCR产物作为模板，采用第一轮引物、引入blocker进行扩增，第一次富集整合DNA；S400. 以步骤S300的PCR产物作为模板，采用第二轮引物、引入blocker进行扩增，第二次富集整合DNA；同时引入测序平台的测序引物结合序列；S500. 对步骤S400的PCR产物上机测序；S600. 过滤测序数据；S700. 根据过滤后的数据判别慢病毒整合位点。2.根据权利要求1所述的一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，所述接头引物为：AdaptorF，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；AdaptorR，核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1所述的一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，所述blocker的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。4.根据权利要求1所述的一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，所述步骤S300中的第一轮引物和S400中的第二轮引物采用巢式引物。5.根据权利要求1所述的一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，所述第一轮引物为：LTRF1，核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；ADR1，核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。6.根据权利要求4所述的一种慢病毒整合位点的检测方法，其特征在于，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启宽，彭祥翔，陈苗苗，刘海迪，李晓那，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：