【技术实现步骤摘要】
一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法
[0001]本专利技术属于数字微流控
,具体涉及一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法。
技术介绍
[0002]单细胞测序技术是鉴定细胞身份、确定细胞状态的有效手段。目前,用于单细胞转录组、单细胞DNA甲基化、单细胞染色质状态分析的单组学分析方法均促进了人们对细胞更深层次的理解。然而细胞内的调控机制是复杂的,不同层面的信息并不是相互独立起作用的,单个层面的信息有限。想要深入理解机体健康维持和疾病发生的机理,本实施例必须进行单细胞多组学测序,用以研究单细胞表观修饰之间的微弱相互作用及其对基因表达的影响。
[0003]由于DNA甲基化、染色质可及性等都是DNA分子上的信息,基因表达是RNA分析信息,通过物理分离细胞质和细胞核,或用polyT尾的磁珠调取走RNA的方式,已经有不少方法实现了单细胞的转录组与DNA甲基化、转录组与染色质可及性的联合分析。通过联合ATAC与亚硫酸盐测序,几个方法实现了DNA甲基化与染色质可及性的联合分析。NOMe
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seq巧妙利用GpC甲基化转移酶对染色质开放区域添加GC甲基化的方式,将染色质可及性检测也转变为甲基化检测,为探索单个细胞的不同层的表观基因组信息提供了机会。scNMT和scNOMeRe在NOMe
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seq的基础上实现了单细胞的三组学分析。然而,现有平台方法均在EP管中挑取单细胞,这一过程耗时耗力且对细胞损伤极大,过长的操作时间往往导致细胞RNA降解,进行影响转录组数据分析的准确 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法,其特征在于:该数字微流控芯片采用lift
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off工艺制成,具有至少一单细胞分离反应单元,该单细胞分离反应单元具有一第一储液区、第二储液区和一混合反应区域,且该数字微流控芯片的相互平行上极板和下极板之间的间隙为60
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180μm;第一储液区具有第一储液电极,第二储液区具有第二储液电极,混合反应区设有多个混合反应电极和一用于捕获单细胞且直径为50
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300μm的亲水位点,第一储液区和通过若干第一输送电极连通混合反应区,第二储液区和通过若干第二输送电极连通混合反应区,通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积小于通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积;具体包括如下步骤:(1)将细胞悬液置于第一储液区内,通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合,产生细胞悬液液滴,接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将该细胞悬液液滴转移至上述亲水位点,使细胞悬液液滴中仅有一个细胞正对下方亲水部,断电静置使该细胞在重力的作用下自然沉降至亲水位点,此时给周围的混合反应电极通电以拖走整个细胞悬液液滴,亲水位点将留有含单个细胞的液滴;(2)清除第一储液区内的液体,将细胞膜裂解液置于第一储液区内,通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合,产生细胞膜裂解液液滴,接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将该细胞膜裂解液液滴转移至上述亲水位点,冰上孵育对细胞膜进行裂解而保持细胞核膜完整,此时给周围的的混合反应电极通电以缓慢转移细胞质部分的液体,亲水位点将留有含单个细胞核的液滴,从而实现细胞核和细胞质的分离;(3)清除第一储液区内的液体,将第一逆转录试剂置于第一储液区内,通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合,产生第一逆转录液滴,将第二逆转录试剂置于第二储液区内,通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合,产生第二逆转录液滴,接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合以及该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将第一逆转录液滴和第二逆转录液滴转移至与上述细胞质部分的液体混合,对细胞质中的RNA进行逆转录,获得细胞质逆转录产物;(4)将cDNA扩增试剂置于第二储液区内,通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合,产生cDNA扩增液滴,接着通过该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将该cDNA扩增液滴转移并与细胞质逆转录产物混合,进行cDNA扩增反应,获得细胞质cDNA扩增产物;然后对该细胞质cDNA产物依次进行片段化和纯化后,进行PCR扩增并添加测序接头,进行illumina二代测序;(5)清除第一储液区内的液体,将GpC甲基转移酶液置于第一储液区内,通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合,产生GpC甲基转移酶液滴,接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将该GpC甲基转移酶
液滴转移至上述亲水位点,与上述含单个细胞核的液滴混合,对细胞核中的开放染色质的GC位点进行甲基化标记;(6)清除第一储液区内的液体,将细胞核裂解液置于第一储液区内,通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合,产生细胞核裂解液液滴,接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合,将该细胞核裂解液液滴转移至上述亲水位点,与其上的液体混...
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