一种利用单一荧光标签的DNA测序方法技术

本发明专利技术涉及一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，先使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节其在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异，再根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。所述DNA测序方法只需要一路激发

【技术实现步骤摘要】
一种利用单一荧光标签的DNA测序方法


[0001]本专利技术涉及一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，属于分子生物学


技术介绍

[0002]荧光标签标记的单分子检测技术可以实现单分子检测，在DNA测序、蛋白相互作用、生物膜作用机制等领域获得了广泛应用。对于DNA测序，通常需要采用至少两种不同发光特性的荧光染料对四种dNTP进行标记，才能实现对基因序列中四种碱基信息的解析。而这需要十分复杂和昂贵的光路系统。
[0003]例如，如果使用两种或者两种以上的荧光标签，一般则需要配备两路或者两路以上具有不同的光谱特性的光路模块，完成光信号的激发、引导和采集功能。如果仅采用一种发射光谱的荧光标签就能对基因序列进行解析，将会极大地减小检测设备系统的复杂性。目前，如何使用一种荧光标签对基因序列的四种碱基进行识别是一项极为艰巨的挑战。鉴于此，需要专利技术一种不依赖复杂光路系统的DNA测序方法。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
[0005]在本专利技术的一种实施方式中，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，以四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光作为唯一自变量，通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述DNA测序方法以相对分子质量或摩尔浓度作为唯一自变量；以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过在四种含有不同碱基的dNTP分子上修饰有数目不等的有机基团，使其形成相对分子质量不同的dNTP分子，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度，使得四种含有不同碱基的dNTP分子与待测序DNA链之间发生结合反应的几率不同，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述四种含有不同碱基的dNTP分子分别为dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5~100:25~10000:125~1000000。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5:25:125、1:10:100:1000、1:50:2500:125000或1:100:10000:1000000。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3~10:9~100:27~1000。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3:9:27、1:4:16:64、1:5:25:125或1:10:100:1000。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：步骤一：对四种含有不同碱基的dNTP分子（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）中的任意三种进行有机基团修饰，得到相对分子质量不同的四种dNTP分子，将相对分子质量不同的四种dNTP分子分别记为m
‑
dATP、m
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP；步骤二：使用同一种荧光标签对步骤一得到的相对分子质量不同的四种dNTP分子进行标记，得到相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子，将相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm
‑
dATP、fm
‑
dTTP、fm
‑
dCTP和fm
‑
dGTP；步骤三：在DNA测序反应体系中，加入fm
‑
dATP、m
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲（荧光信号脉冲是指荧光信号强度波动曲线的峰，对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，即可识别出脉冲）；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线K
A
；步骤四：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应的等待时间直方图以及dNTP的反应速率模型曲线K
T
、K
C
、K
G
（例如，在DNA测序反应体系中，加入m
‑
dATP、fm
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。2.如权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA测序方法以相对分子质量或摩尔浓度作为唯一自变量；以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过在四种含有不同碱基的dNTP分子上修饰有数目不等的有机基团，使其形成相对分子质量不同的dNTP分子，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度，使得四种含有不同碱基的dNTP分子与待测序DNA链之间发生结合反应的几率不同，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。3.如权利要求2所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5~100:25~10000:125~1000000；以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3~10:9~100:27~1000。4.如权利要求1~3任一项所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：步骤一：对四种含有不同碱基的dNTP分子中的任意三种进行有机基团修饰，得到相对分子质量不同的四种dNTP分子，将相对分子质量不同的四种dNTP分子分别记为m
‑
dATP、m
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP；步骤二：使用同一种荧光标签对步骤一得到的相对分子质量不同的四种dNTP分子进行标记，得到相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子，将相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm
‑
dATP、fm
‑
dTTP、fm
‑
dCTP和fm
‑
dGTP；步骤三：在DNA测序反应体系中，加入fm
‑
dATP、m
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线K
A
；步骤四：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，
重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应的等待时间直方图以及dNTP的反应速率模型曲线K
T
、K
C
、K
G
；步骤五：以步骤三和步骤四获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：步骤一：将四种含有不同碱基的dNTP分子分别记为m
‑
dATP、m
‑
dTTP、m
‑
dCTP和m
‑
dGTP；使用同一种荧光标签对四种dNTP分子进行标记，得到经荧光标签标记的四种d...

【专利技术属性】
技术研发人员：周连群，高庆学，郭振，张威，李金泽，李传宇，姚佳，李树力，李超，杨弃，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：